2',7'-Dichlorofluorescein diacetate

本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。

1. 制备染色液

(1)配置储存液:使用DMSO溶解2',7'-Dichlorofluorescein diacetate（DCFH2-DA），配置浓度为1-10mM的储存液。

注意:未使用的储存液分装后在-20℃或-80°C避光保存，避免反复冻融。

(2)配置工作液:用合适的缓冲液(如:无血清培养基或PBS)稀释储存液，配制浓度为1-100μM的工作液。

注意:请根据实际情况调整工作液浓度，现用现配。

2.细胞悬浮染色

(1)悬浮细胞：经4°C、1000g离心3-5分钟，弃去上清液，用PBS清洗两次，每次5分钟。

(2)贴壁细胞：使用PBS清洗两次，加入胰酶消化细胞，消化完成后经1000g离心3-5min。

(3)加入DCFH2-DA工作溶液重悬细胞，室温避光孵育5-30分钟。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索。

(4)孵育结束后，经1000g离心5分钟，去除上清液，加入PBS清洗2-3次，每次5分钟。

(5)用预温的无血清细胞培养基或PBS重悬细胞，通过荧光显微镜或流式细胞术观察。

3.细胞贴壁染色

(1)在无菌盖玻片上培养贴壁细胞。

(2)从培养基中移走盖玻片，吸出过量的培养基，将盖玻片放在潮湿的环境中。

(3)从盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞。

(4) 室温避光孵育5-30分钟。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索。

(5)孵育结束后吸弃染料工作液，使用预温的培养液清洗盖玻片2~3次。

4.显微镜检测：DCFH2-DA的最大吸收/发射波长为492/515nm。

注意事项：

1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。