Ac-ANW-AMC
(Synonyms: Ac-Ala-Asn-Trp-AMC) 目录号 : GC42685Ac-ANW-AMC是20S免疫蛋白酶体的β5i（LMP7/PSMB8）亚基的荧光底物，最大激发波长λEx=345nm, 最大发射波长λEm=445nm。
Cas No.:2357123-49-8
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
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Ac-ANW-AMC is a fluorescent substrate for the β5i (LMP7/PSMB8) subunit of the 20S immunoproteasome, with a maximum excitation wavelength of λEx=345nm and a maximum emission wavelength of λEm=445nm[1, 2]. When a specific enzyme acts on Ac-ANW-AMC, it releases the fluorophore 7-amido-4-methylcoumarin (AMC). The activity of the enzyme can be quantitatively analyzed by measuring the fluorescence intensity of AMC[3]. The fluorescence signal of Ac-ANW-AMC can be effectively eliminated by the i-proteasome inhibitor ONX-0914[4].
References:
[1] Winter M B, La Greca F, Arastu-Kapur S, et al. Immunoproteasome functions explained by divergence in cleavage specificity and regulation[J]. Elife, 2017, 6: e27364.
[2] Erokhov P A, Kulikov A M, Karpova Y D, et al. Proteasomes in patient rectal cancer and different intestine locations: where does proteasome pool change?[J]. Cancers, 2021, 13(5): 1108.
[3] Mustafa M S, El-Abadelah M M, Mubarak M S, et al. Synthesis and fluorogenic properties of some 1-(coumarin-7-yl)-4, 5-dihydro-1, 2, 4-triazin-6 (1H)-ones[J]. International Journal of Chemistry, 2011, 3(4): 89.
[4] Kim S, Park S H, Choi W H, et al. Evaluation of Immunoproteasome-Specific Proteolytic Activity Using Fluorogenic Peptide Substrates[J]. Immune Network, 2022, 22(3).
Ac-ANW-AMC是20S免疫蛋白酶体的β5i（LMP7/PSMB8）亚基的荧光底物，最大激发波长λEx=345nm, 最大发射波长λEm=445nm[1, 2]。当特定酶作用于Ac-ANW-AMC时，会释放出荧光团7-amido-4-methylcoumarin (AMC)，通过测量AMC的荧光强度可以定量分析酶的活性[3]。Ac-ANW-AMC的荧光信号能够被i-蛋白酶体抑制剂ONX-0914有效消除[4]。
本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。
1. 溶液配制
(1)工作液：用DMSO溶解Ac-ANW-AMC，用实验缓冲液稀释到所需的工作浓度，如:30-100μM[1, 2]。
注意：最佳的工作浓度请根据实际情况调整或参阅文献自行设置梯度浓度进行摸索。工作液必须现配现用。
2. 通过监测Ac-ANW-AMC随时间水解的速率来测量β5i的催化活性[1](来自文献,仅做参考)
(1) 使用被动裂解缓冲液（Passive Lysis Buffer）制备蛋白质裂解物，并在20S蛋白酶体测定缓冲液（20mM Tris-HCl，0.5mM EDTA，0.035％SDS，pH 8.0）中稀释。
(2) 添加100μM Ac-ANW-AMC引发β5i的催化反应。
(3) 使用酶标仪在激发波长和发射波长分别为360nm和460nm下，在1h内以每分钟读数一次的方式测量荧光信号。
3.用Ac-ANW-AMC测定蛋白酶体LMP7活性[2](来自文献,仅做参考)
(1) 反应混合物含有20mM Tris-HCl（pH 7.5）、30μM Ac-ANW-AMC、1mM二硫苏糖醇（DTT）、5mM MgCl2和1mM ATP。
(2) 为了计算非蛋白酶体蛋白水解活性的贡献，使用7μM MG 132（蛋白酶体抑制剂）。加入0.5、1.0、1.5和2.0μL澄清匀浆至总体积为100μL后，在37℃下反应20min，并用1% SDS终止。
(3) 产物用荧光计检测，激发波长380nm，发射波长440nm。在MG 132存在下总活性和残余活性之间的差异被确定为蛋白酶体活性。
References:
[1] Lee M J, Miller Z, Park J E, et al. H727 cells are inherently resistant to the proteasome inhibitor carfilzomib, yet require proteasome activity for cell survival and growth[J]. Scientific reports, 2019, 9(1): 4089.
[2] Erokhov P A, Kulikov A M, Karpova Y D, et al. Proteasomes in patient rectal cancer and different intestine locations: where does proteasome pool change?[J]. Cancers, 2021, 13(5): 1108.
| Cas No. | 2357123-49-8 | SDF | |
| 别名 | Ac-Ala-Asn-Trp-AMC | ||
| 化学名 | (S)-N1-((S)-3-(1H-indol-3-yl)-1-((4-methyl-2-oxo-2H-chromen-7-yl)amino)-1-oxopropan-2-yl)-2-((S)-2-acetamidopropanamido)succinamide | ||
| Canonical SMILES | O=C1C=C(C)C2=C(C=C(NC([C@H](CC3=CNC4=C3C=CC=C4)NC([C@H](CC(N)=O)NC([C@H](C)NC(C)=O)=O)=O)=O)C=C2)O1 | ||
| 分子式 | C30H32N6O7 | 分子量 | 588.6 |
| 溶解度 | 10mM in DMSO | 储存条件 | Store at -20°C, protect from light |
| General tips | 请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。 储备液的保存方式和期限：-80°C 储存时，请在 6 个月内使用，-20°C 储存时，请在 1 个月内使用。 为了提高溶解度，请将管子加热至37℃，然后在超声波浴中震荡一段时间。 |
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| Shipping Condition | 评估样品解决方案：配备蓝冰进行发货。所有其他可用尺寸：配备RT，或根据请求配备蓝冰。 | ||
| 制备储备液 | |||
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1 mg | 5 mg | 10 mg |
| 1 mM | 1.6989 mL | 8.4947 mL | 16.9895 mL |
| 5 mM | 0.3398 mL | 1.6989 mL | 3.3979 mL |
| 10 mM | 0.1699 mL | 0.8495 mL | 1.6989 mL |
| 第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量） | ||||||||||
| 给药剂量 | mg/kg |  |
动物平均体重 | g | |
每只动物给药体积 | ul | |
动物数量 | 只 |
| 第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶于水的药物；不同批次药物配方比例不同，请联系GLPBIO为您提供正确的澄清溶液配方） | ||||||||||
| % DMSO % % Tween 80 % saline | ||||||||||
| 计算重置 | ||||||||||
计算结果:
工作液浓度： mg/ml；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL，
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL saline，混匀澄清。
1. 首先保证母液是澄清的；
2.
一定要按照顺序依次将溶剂加入，进行下一步操作之前必须保证上一步操作得到的是澄清的溶液，可采用涡旋、超声或水浴加热等物理方法助溶。
3. 以上所有助溶剂都可在 GlpBio 网站选购。
Quality Control & SDS
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