Annexin V-Cy5/SYTOX Green Apoptosis Detection Kit

本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。

一、细胞悬浮染色：

1、悬浮细胞染色

（1）细胞经1000g离心5分钟，弃上清，用适量PBS轻轻重悬细胞并计数。

注意：PBS重悬细胞也起到了洗涤细胞的作用，可以保证后续Annexin V-Cy5的结合不受干扰，此步骤不可省略。

（2）取约5-10×10⁴个细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V Binding Buffer轻柔重悬细胞。

（3）加入5μl Annexin V-Cy5和1μl SYTOX Green染色液，轻柔混匀。

（4）室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟。

注意：孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。

（5）将样本转移至冰浴中，建议使用铝箔避光处理。

（6）使用流式细胞仪或荧光显微镜对染色结果进行检测。

2. 对于贴壁细胞的消化后检测：

（1）（重要）将细胞培养基吸出，转移至合适大小的离心管内。

（2）（关键）使用PBS轻柔清洗一次贴壁培养的细胞，加入适量胰酶细胞消化液消化细胞，室温孵育至细胞形状逐渐变圆并变得松散、轻轻晃动出现细胞脱落，立即向消化好的细胞中加入步骤（1）收集的细胞培养基终止消化，将细胞轻柔吹打下来。

注意：

①  建议在此步骤使用步骤（1）中收集的细胞培养基终止消化，也能够收集悬浮在培养基的发生凋亡或坏死的细胞。

②  胰酶消化需要适当。消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜损伤，从而导致细胞坏死的假阳性；消化时间如果过长，同样易造成细胞膜损伤而出现假阳性，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-Cy5的结合，从而干扰对细胞凋亡的检测。

③  胰酶细胞消化液中应尽量不含EDTA。Annexin V是Ca²⁺依赖的蛋白，EDTA可以螯合Ca²⁺，从而影响Annexin V和磷脂酰丝氨酸（PS）结合，影响实验结果。

④  如果使用含EDTA的胰酶消化细胞，建议在消化结束后、加Annexin V-Cy5前使用PBS多清洗几次细胞，能够去除EDTA对凋亡检测的影响。

（3）将细胞液转移至离心管中，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。

注意：此步骤应尽量去除胰酶，残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-Cy5，影响染色效果。

（4）取约5-10×10⁴个细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入195μl Annexin V Binding Buffer轻柔重悬细胞。

（5）加入5μl Annexin V-Cy5和1μl SYTOX Green染色液，轻轻混匀，室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟。

注意：孵育过程中可以重悬细胞2-3次以改善染色效果。

（6）将样本转移至冰浴中，建议使用铝箔避光处理。

（7）使用流式细胞仪或荧光显微镜对染色结果进行检测。

二、贴壁细胞的原位荧光检测：

1、(选做)如果条件允许，建议在凋亡诱导结束后将多孔板经1000g离心5分钟。

2、吸弃细胞培养基，加入PBS洗涤一次。如果条件允许，建议在吸弃PBS前将多孔板经1000g离心5分钟。

3、加入195μl Annexin V Binding Buffer。

4、加入5μl Annexin V-Cy5和1μl SYTOX Green染色液，轻轻混匀，室温(20-25℃)避光孵育10-20分钟。

5、将样本转移至冰浴中，建议使用铝箔避光处理。

6、使用荧光显微镜对染色结果进行检测。

注意事项：

1、  细胞在染色后应尽快检测，建议在1小时之内完成检测，不建议将细胞在结合液中保存过久。

2、  如果用于流式细胞仪检测，可立即上机检测。Annexin V-Cy5为红色荧光，最大激发/发射波长为650/670nm。SYTOX Green为绿色荧光，最大激发/发射波长为504/523nm。

3、  染色完成后可以不更换掉染色液，直接上机检测。如果不能立即检测，建议离心去除染色液，使用PBS或Annexin V Binding Buffer重悬细胞。

4、  如果细胞在悬浮染色后使用荧光显微镜检测，建议1000g离心5分钟收集细胞，使用50-100μl Annexin V Binding Buffer轻轻重悬细胞，涂片后在荧光显微镜下观察。

5、  在初次使用流式细胞仪进行检测时，建议设置未染色、SYTOX Green单染和Annexin V-Cy5单染3组对照。

6、  在使用流式细胞仪进行检测时，如果发现Annexin V-Cy5单独染色时出现了过多的SYTOX Green假阳性细胞，并且通过调整相关设置和参数也无法改善，可以用PBS将Annexin V-Cy5稀释3-10倍后再进行检测。

7、  本产品只适用于细胞模型的凋亡双染，也适用于检测精子凋亡，但不能用于检测组织样本中的凋亡。

8、  Annexin V-Cy5通过结合磷脂酰丝氨酸（PS）对凋亡细胞进行标记，PS在不同种属间相对保守，故而本产品适用于对不同种属的细胞进行凋亡检测，具体实验步骤可参考相关文献。

9、  本产品能够和抗体一起对细胞进行染色，但建议分开染色，建议在抗体染色完成后将缓冲液更换为Annexin V结合液进行凋亡检测。

10、  如果样品来源于血液，必须去除血液中的血小板，血小板中的PS会干扰实验结果。

11、  神经细胞膜容易破坏外翻，从而导致假阳性，所以本产品不适用于检测神经细胞的凋亡。

12、  操作中务必动作轻柔，离心后需确认管底是否有细胞。

13、  荧光染料均存在淬灭问题，实验过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

14、  为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。