Anti-FLAG G1 Affinity Resin

I. 纯化需要的设备和试剂（本产品不提供）

• 蒸馏
• 微量移液器
• 微量离心管
• 涡旋混合器
• 加样槽
• 空柱子
• 血清移液管(5 ml, 10 ml)
• 细胞裂解缓冲溶液
• 蛋白酶抑制剂
• 缓冲溶液(表2列出了使用Anti‐DYKDDDDK G1 Affinity Resin所需的缓冲溶液)

表2. 使用Anti‐DYKDDDDK G1 Affinity Resin所需的缓冲溶液

II. 使用说明

1. 样品制备
为了获得最佳结果，请遵循以下样品制备建议。
1) 根据蛋白特性制备样品，优化裂解条件，最大限度地减少干扰目标蛋白结合的因素(见试剂相容性表)。
2) 对于DYKDDDDK标签蛋白的结合步骤，在中性pH下选用适当的盐(NaCl)浓度作为缓冲溶液。
3) 样品不应含有不溶性颗粒。在进行上样结合步骤前，先过滤样品或在4°C下高速离心10‐15分钟，以去除不溶性物质。
4) 为了防止纯化过程中蛋白质的降解，可以在细胞裂解过程中冰制样品/或在样品中加入蛋白酶抑制剂。
5) 细胞裂解时，加入内切酶，降低因染色体DNA或RNA释放引起的样品粘性。
6) 避免频繁的反复冻融。将裂解液/样品分成等份，并在‐80°C下存储。
2. 准备填料
1) 将一根空柱子放在一个坚固的支撑物上;用TBS冲洗柱子一次。
2) 轻柔的反转填料以便将其彻底重悬，并立即将适量的浆液装入柱子内。为了方便填料浆液转移，建议使用宽口径吸管头。
3) 重复三次用3倍柱体积的TBS洗涤平衡填料。让缓冲溶液通过重力从柱子中流出; 不要让填料变干。
3. 结合步骤
Anti‐DYKDDDDK G1 Affinity Resin可以通过柱色谱、批量结合或免疫沉淀(IP)等不同方法纯化DYKDDDDK标签蛋白。如果样品体积在50ml左右，且DYKDDDDK标签蛋白的含量小于4mg，则建议采用2‐4ml沉淀填料的柱结合方式。对于更大的样本体积，推荐批量结合方式使纯化变得快速和高效。对于小体积低蛋白表达量的样本，可采用免疫沉淀的方法(见第III.7节DYKDDDDK标记蛋白的免疫沉淀)
3.1 柱层析法
1) 将制备好的样品在室温重力流速下加载到柱子上。在柱子的底部安装一个缓冲溶液储存器以便接收大量的流穿液体。多次收集和重新加载样品流穿液以获得最大的结合载量。较低的流速可以促进目标蛋白与填料更好的结合。
2) 用10-20柱体积的TBS清洗柱子，以减少非特异性结合。
3) 让液面和树脂平面相切时，进入洗脱程序。(见第III.4节DYKDDDDK标记蛋白的洗脱)
3.2 批次结合
1) 将柱子中准备好的填料(如第III.2节所述)与含有目的蛋白的制备样品充分混合重悬。
2) 将重悬的树脂转移到剩余的样品溶液里。室温下样品与Anti‐DYKDDDDK G1 Affinity Resin旋转孵育至少30分钟。
3) 孵育后，将样品与填料装入另一个柱子上收集填料。保存样品的流穿液，以供进一步使用。
4) 用10 ~ 20倍体积的TBS清洗填料，以去除任何非特异性的结合杂质。
5) 让液面和树脂平面相切时，进入洗脱程序。(见第III.4节DYKDDDDK标记蛋白的洗脱)
备注:
1. 通过经验可以延长结合时间。孵育可以在4°C下过夜进行，缓慢旋转混匀。为防止蛋白质降解，应在样品中加入蛋白酶抑制剂。
2.通过SDS–PAGE 分析 或 Western Blot 检测， 确定 DYKDDDDK 标签蛋白的结合效率。
4. DYKDDDDK标记蛋白的洗脱
根据蛋白质特性和下游应用推荐五种洗脱方法。所选择的洗脱方法应保持蛋白质结构的完整性和生物学功能，并与下游应用兼容。多种洗脱方法可联合使用，以达到最佳效果。所有方法均可在室温下进行; 根据特殊要求，可能需要降低温度。在最后的清洗步骤后，立即将洗脱缓冲溶液装入柱上。关于推荐的洗脱缓冲溶液的配方，请参阅第二节，需要但不提供的设备和试剂。
4.1 用pH 12.0的碱性洗脱缓冲溶液洗脱
用6个柱体积的碱性洗脱缓冲溶液(pH 12.0)洗脱结合的DYKDDDDK标记蛋白，洗脱液进入包含1/20柱床体积1M HCl的小瓶中以便中和洗脱液。以1ml沉淀填料为例，用6×1ml洗脱缓冲溶液依次洗脱，分别用6个小瓶(含50 μl 1M HCl)收集洗脱液。不要将柱子放在碱性洗脱缓冲溶液中超过15分钟; 洗脱后立即重新平衡色谱柱。(参见III.5的一节)
4.2 用pH 10.5的碱性洗脱缓冲溶液洗脱
该缓冲溶液的pH值(10.5)低于碱性洗脱缓冲溶液(pH 12)，有助于保持靶蛋白的生物活性。在某些情况下，这一过程可能不能像碱性洗脱缓冲溶液(pH 12.0)那样回收较多的DYKDDDDK标签蛋白。用6倍柱床体积的碱性洗脱缓冲溶液(pH 10.5)将结合的目标蛋白洗脱到包含1/40床体积1M HCl的小瓶中。不要将柱放在碱性洗脱缓冲溶液中超过15分钟; 洗脱后立即重新平衡色谱柱。(见第III .5节重新平衡)
4.3 用0.1 M酸洗脱缓冲溶液洗脱
用6个柱体积的酸性洗脱缓冲溶液(pH 3.5)洗脱结合的目标蛋白，进入包含1/20床体积1 M Tris的小瓶，pH 9.0。色谱柱在酸性洗脱缓冲溶液中停留时间不要超过15分钟;洗脱后立即重新平衡色谱柱。
4.4 用竞争洗脱缓冲溶液洗脱
与添加的DYKDDDDK或FLAG®肽竞争性结合可以洗脱结合的靶蛋白。竞争性洗脱缓冲溶液中DYKDDDDK或FLAG®肽的浓度在100‐500µg/ml之间。通过重力流速将2‐3柱床体积的竞争性洗脱缓冲溶液装入柱中;在填料上方留有约1倍柱床体积的洗脱缓冲溶液时，封住柱子底部液体出口，在室温下孵育30‐60分钟; 打开色谱柱的末端，收集洗脱液。洗脱后，用0.1 M酸洗脱缓冲溶液将结合在柱子上的竞争多肽洗脱下来。
4.5 中性洗脱缓冲溶液洗脱
高浓度的NaCl可以洗脱DYKDDDDK标记蛋白。依次将5x1床体积的3M NaCl缓冲溶液(pH 7.4)加载到柱上，收集洗脱液。当3M NaCl不能完全洗脱靶蛋白时，NaCl浓度可提高到4M。
5. 重新再平衡
洗脱后，用TBS缓冲溶液清洗填料，去除残留的洗脱缓冲溶液，残留的洗脱缓冲溶液可能使固定在填料上的G1抗体变性。建议每次用5-10倍柱床体积的TBS缓冲溶液清洗填料3次。在最后一次洗涤后，让TBS缓冲溶液与填料液面相切时，然后在填料中加入2倍柱床体积的TBS以备下次使用。
6. Anti‐DYKDDDDK G1 Affinity Resin 的再生
Anti‐DYKDDDDK G1 Affinity Resin可以重复使用多次来纯化相同的蛋白而不需要再生。
如果要纯化的目标DYKDDDDK标签蛋白不同，则必须使用以下方案再生填料:
6.1 用0.1 M Tris HCl, 0.5 M NaCl, pH 8.0的2倍柱床体积洗涤填料。
6.2 用0.1 M醋酸钠，0.5 M NaCl, pH 4.0的2倍柱床体积洗涤填料。
6.3 用3‐5倍柱床体积的TBS重新平衡填料。
6.4 为了长期储存，填料应储存在含有0.02%叠氮化钠的TBS中，温度为2-8℃
7. DYKDDDDK标签蛋白的免疫沉淀
对于从少量起始样品(例如1-2毫升细胞裂解液)中纯化目的蛋白，可以使用免疫沉淀步骤。
7.1 重悬填料形成均匀的浆液，将40‐100 μl浆液转移到1.5 ml离心管中。
备注: 建议使用大口径吸液头转移填料浆液。
7.2 在离心中加入500 μl TBS，轻轻混合填料。6000×g离心30秒，小心吸走上清液，重复这个步骤两次。每次清洗后，小心地尽可能多地吸走上清液，且不要触碰沉淀的填料。
7.3 向洗涤后的填料中加入样品。如样品体积小于1ml，加入裂解缓冲溶液或TBS使样品总体积为1ml。
7.4 在室温条件下，用管式旋转器首尾相连旋转混合至少1小时。
备注:为了达到最佳的洗脱效果，可延长孵育时间，也可降低孵育温度。
7.5离心6,000×g 30秒。仔细移除上清液，加入TBS清洗填料三次。在不干扰填料的情况下尽可能多地清除上清液，进入洗脱步骤。
7.6极端pH条件或DYKDDDDK八肽可以洗脱DYKDDDDK标签蛋白。与目的蛋白结合的填料也可以直接用于SDS-PAGE分析。根据目的蛋白的特性及下游应用选择以下两种洗脱方法之一。
1) 用pH 12.0的碱性洗脱缓冲溶液洗脱
将120‐300 μl(3个柱体积)的碱性洗脱缓冲溶液加入到清洗后的填料中，使用一个宽孔吸液管头轻轻重悬填料。在室温下孵育5分钟，孵育期间轻轻拍打试管1-2次。孵育后，6000×g离心30秒。小心地将上清液转移到一个含有5‐15 μl 1m HCl的新瓶中以供进一步使用。
2) 用酸洗脱缓冲溶液洗脱
在清洗后的填料中加入120‐300 μl(3个柱体积)的酸洗脱缓冲溶液，使用一个宽孔吸液管尖端轻轻重悬填料。在室温下孵育5分钟，孵育期间轻轻拍打试管1-2次。孵育后，6000×g离心30秒。小心地将上清液转移到含有5‐15 μl 1m Tris, pH为9.0的新瓶中供进一步使用。
3) 用竞争洗脱缓冲溶液洗脱
将120‐300 μl(3个柱体积)的100 μg/ml DYKDDDDK八肽洗脱缓冲溶液加入到洗涤后的填料中，使用宽孔吸液管顶端轻轻重悬填料。在室温下孵育5分钟，孵育期间轻轻拍打试管1-2次。孵育后6000×g离心30秒。小心地将上清液转移到一个新的小瓶中以便进一步使用。
4) 中性洗脱缓冲溶液洗脱
向洗涤后的填料中加入120‐300 μl(3柱体积)3M NaCl, pH 7.4，使用一个宽孔吸液器尖端轻轻重悬填料。在室温下孵育5分钟，孵育期间轻轻拍打试管1-2次。孵育后，6000×g离心30秒。小心地将上清液转移到一个新的小瓶中以便进一步使用。
5) PAGE凝胶样品缓冲溶液洗脱
为了尽量减少固定在填料的G1抗体的变性和洗脱，样品缓冲溶液中不应包含还原试剂(β-巯基乙醇或DTT)。还原试剂将分解G1抗体的重链和轻链。如果还原条件绝对必要，可以加入还原剂。请参考试剂相容性表3。
在洗涤后的填料中加入40‐100 μl(1柱体积)的PAGE凝胶样品缓冲溶液，混匀。煮沸3分钟，8000 × g离心30秒。小心地将上清液倒入一个新的小瓶中。

III. 试剂兼容性表

所列试剂的耐受浓度是通过在指示浓度下添加所列试剂来检测的。

表3 试剂兼容性

IV. 问题处理