Anti-Flag Magnetic Beads

1. 磁珠预处理
混悬 Anti-Flag Magnetic Beads, 取 10 μL 磁珠, 置于 1.5 mL EP 管中, 加入 500 μL 洗涤缓冲液, 充分混悬, 置于磁力架上磁性分离, 弃上清. 重复以上洗涤步骤 2 次.
2. 样品的结合
在上述分离得到的磁珠中加入 500 μL 细胞裂解液, 充分混悬, 置于翻转混合仪孵育, 室温孵育 2 小时或者 4 ºC 条件下孵育过夜. 置于磁力架上磁性分离, 弃上清.
注意：结合过程中, 磁珠可能会出现聚团或呈片状, 属于正常现象, 不会影响实验结果.
3. 洗涤
在上述分离得到的磁珠中加入 500 μL 洗涤缓冲液, 充分混悬磁珠, 磁性分离, 弃上清. 重复以上洗涤步骤 3 次, 直到洗涤后的上清液中 OD280小于 0.05 为止.
注意：如上清液的 OD280 大于 0.05, 适当增加洗涤次数即可.
4. 洗脱
本说明书提供三种 Flag 标签蛋白洗脱方案, 操作者可以根据后期检测的需要选择不同的洗脱方案.
a. 变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于 SDS-PAGE 检测.
步骤：分离磁珠, 弃上清, 向磁珠中加入 50 μL 的 1×SDS -PAGE Loading Buffer 混合均匀, 95 ºC 加热 5 分钟. 分离磁珠, 收集上清至新的 EP 管, 进行 SDS-PAGE 检测.
b. 酸性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有生物活性, 可用于后期功能分析.
步骤：分离磁珠, 弃上清, 向磁珠中加入 50 μL 的洗脱缓冲液 A 混合均匀, 室温孵育 10 分钟. 分离磁珠, 收集上清至新的 EP 管, 按每 50 μL 洗脱液加入 25 μL 中和缓冲液的比例加入中和缓冲液, 将洗脱产物 pH 调节至中性, 样品用于后期功能分析.
c. 竞争性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有生物活性, 可用于后期功能分析.
步骤：分离磁珠, 弃上清, 向磁珠中加入 3-5 倍磁珠体积的洗脱缓冲液 B混合均匀, 室温孵育 1 小时或者 4 ºC 条件下孵育 1-2 小时. 分离磁珠, 收集上清至新的 EP 管, 即为目的蛋白, 样品用于后期功能分析.

注意事项
1. 本产品 pH 值为 6-8, 禁止冻结.
2. 本产品应避免离心、干燥或冻存, 禁止长时间置于磁场, 可能会引起磁珠聚团, 操作过程应轻柔, 避免抗体脱落.
3. 使用本产品进行 IP 实验前, 需先确认样品中 Flag 标签融合蛋白的表达情况.
4. 为最大限度的降低蛋白质降解, 请配合使用蛋白酶抑制剂cocktails (产品目录号: GK10014, GK10019).
5. 不要使用含有 dithiothreitol (DTT) 的细胞裂解液样品, DTT 可能会引起磁珠上的 Flag 抗体脱落.
6. 本产品仅限于专业人员的科学研究用, 不得用于临床诊断或治疗, 不得用于食品或药品.
7. 为了您的安全和健康, 请穿实验服并戴一次性手套操作.

常见问题
1. 检测结果条带背景过高？
A. 可能是由于蛋白非特异性结合到抗体、磁珠或 EP 管上, 建议对裂解液进行预处理, 去除非特异结合的蛋白；在最后一次洗涤前, 转移整个样品到新的EP 管中, 然后磁性分离或离心分离.
B. 洗涤效果不佳, 也会导致条带较高的背景, 建议增加洗涤时间与次数.
2. 检测结果无条带？
A. Flag 标签融合蛋白没有表达可能导致检测结果无条带: 建议操作: a. 确保目的蛋白带有 Flag 标签; b. 制备新鲜的裂解液; c. 使用恰当的蛋白酶抑制剂.
B. 孵育时间不足可能导致检测结果无条带, 建议延长孵育时间.
C. 裂解液中存在高浓度的 DTT, 2-巯基乙醇或其他的还原剂等干扰物质, 建议选用合适的裂解液.