METTL3的小分子抑制作为一种用于治疗髓系白血病的策略

摘要：

n6-甲基腺苷(m6A)是一种内部RNA修饰酶，主要由METTL3-METTL14甲基转移酶复合物催化。m6A甲基转移酶METTL3与急性髓系白血病(AML)的起始和维持有关，但靶向该酶的应用潜力仍不清楚。在这里，研究者们介绍了STM2457的鉴定和特性，以及STM2457与METTL3-METTL14复合物的晶体结构。STM2457是一种高效选择性的METTL3催化抑制剂，用STM2457治疗肿瘤可导致AML生长减少，分化和凋亡增加。伴随着致白血病性mRNA的m6A水平的选择性降低，与翻译缺陷相一致的表达减少。研究者们证明，在体内METTL3的抑制会导致各种AMTL小鼠模型的移植受损并延长生存期，特别是针对AML的关键干细胞亚群。总的来说，这些结果揭示了抑制METTL3作为一种对抗AML的潜在治疗策略，RNA修饰酶的靶向是一种很有前途的抗癌治疗途径。

研究内容：

分为以下部分：STM2457表征+STM2457的细胞和分子效应+STM2457体内疗效

1.RNA甲基转移酶抑制剂STM2457的表征

Fig. 1 | Characterization of the RNA methyltransferase inhibitor STM2457. a, Chemical structure of STM2457. b, Biochemical activity assay showing inhibition of the METTL3–METTL14 (METTL3/14) enzyme complex using a dose-range of STM2457 and STM2120. c, SPR assay showing binding affinity of STM2457 to the METTL3–METTL14 protein complex. RU, relative units. d, SPR assay showing binding affinity to the METTL3–METTL14 protein complex is reduced in the presence of SAM, indicative of SAM-competitive binding. e, STM2457 selectively inhibits METTL3–METTL14 in a methyltransferase profiling panel of 45 RNA (red bars), DNA (green bars) and protein methyltransferases (grey bars) (asterisk indicates less than 50% activity remaining) (n = 2). f, Crystal structure of METTL3–METTL14 (carbon atoms in green) in complex with STM2457 (carbon atoms in cyan). Hydrogen bonds (yellow dashed lines) and water molecules proximal to the inhibitor (red sphere) are shown (Protein Data Bank (PDB) ID 7O2I). g, Quantification of m6A levels on poly-A+-enriched RNA (expressed as m6A/AGCU ratio) after 24 h of treatment of MOLM-13 cells with the indicated STM2457 concentrations. Data are mean ± s.d., n = 3

为了研究靶向METTL3的酶活性作为一种抗白血病策略的治疗潜力，研究者们开发了小分子STM2457。研究者们对25万种不同的化合物进行了高通量筛选。STM1760 (半抑制浓度=51.7μM)是由筛选产生的仅有的两个非s-腺苷蛋氨酸(SAM)相关的结果之一(扩展数据图1a，b)。在优化了效力、体外吸收-分布代谢-排泄(ADME)研究和体内药代动力学特性后，研究者们鉴定了STM2457(图1a)。研究者们还鉴定了结构相关的分子STM2120(半抑制浓度=64.5μM)，它对METTL3-METTL14的活性比STM2457低1000倍。(图1b)

STM2457是一种有效的METTL3-METTL14催化抑制剂，半抑制浓度为16.9nM(图1b)。通过表面等离子体共振(SPR)证实了与METTL3-METTL14异质二聚体的直接结合(图1c、d，扩展数据图。1c–e)。在SPR运行的缓冲液中，使用SAM证明了一种辅助因子竞争结合模式(图1d)。STM2457对METTL3具有高度特异性，对其他RNA甲基转移酶没有抑制作用(扩展数据图1f)。此外，当对45个RNA、DNA和蛋白质甲基转移酶进行测试时，STM2457对METTL3的选择性在1000倍以上(图1e)。研究者们通过X射线晶体学进一步对STM2457与METTL3的结合进行了表征，证实了STM2457与SAM结合位点的结合(图1f)。在甲基转移酶面板中观察到的STM2457与SAM的强选择性和其他已知甲基转移酶抑制剂的结构不同，避免SAM使用的同型半胱氨酸结合，STM2457结合上K513的重组，以及SAM依赖的甲基转移酶辅助因子结合位点的结构多样性。

2. METTL3的药物抑制影响AML细胞

Fig. 2 | Pharmacological inhibition of METTL3 affects AML cells. a, STM2457 dose–response curves for a panel of AML cell lines. Data are mean ± s.d., n = 3. IC50 for each cell line is shown in brackets. b, Colony-forming efficiency of primary mouse MLL-AF9/Flt3Itd/+ and NPM1c/Flt3Itd/+ AML cells treated with vehicle or STM2457. Data are mean ± s.d., n = 3. CFU, colony-forming units. c, Colony-forming efficiency of wild-type (WT) Lin- cells treated with vehicle or STM2457. Data are mean ± s.d., n = 3. d, CD11b and MAC1 levels of MOLM-13 and MLL-AF9/Flt3Itd/+ primary mouse cells, respectively, treated with vehicle or STM2457. e, BrdU staining and cell cycle analysis in MOLM-13, HPC7 and MLL-AF9/Flt3Itd/+ primary mouse cells treated with vehicle or STM2457. f, Percentage of apoptotic cells in a panel of human AML cell lines following treatment with STM2457 at the indicated time points. Data are mean ± s.d., n = 3. g, Western blot analysis of BRD4, MYC, SP1 and GAPDH in MOLM-13 cells treated with the indicated doses of STM2457 or vehicle (n = 3). Two-tailed Student’s t-test; *P < 0.01, **P < 0.0001; NS, not significant. CFU, colony-forming units.

STM对人和小鼠2457对人和小鼠METTL3具有等效抑制作用(扩展数据图。2b)。STM2457的半抑制浓度与细胞半抑制浓度的差异与METTL3-METTL14的SAM9的Michalis常数(Km)(0.1μM)和细胞内高度丰富的SAM10的竞争一致。研究者们通过测量poly-A+富集RNA的浓度依赖性降低，进一步证明了细胞中STM2457的靶点抑制作用(图1g)。其他RNA修饰均未检测到变化(扩展数据图2d)。单次腹腔剂量为50mg/kg后，STM2457在小鼠中的药代动力学分析表明，STM2457的半衰期足够，以确保在体内24小时内的适当暴露水平(扩展数据图2e)。m6A对小鼠脾脏中poly-A+富集RNA的剂量依赖性抑制证实了化合物暴露与体内靶标抑制之间的明确关系(扩展数据图2f)。这些数据表明，STM2457是一种高效的、特异性的和生物可利用的METTL3抑制剂，适用于体内研究。

3. STM2457降低m6A水平，导致mRNA翻译缺陷

Fig. 3 | STM2457 reduces m6A levels and causes mRNA translation defects. a, Genomic distribution of all called m6A peaks (left) and downregulated m6A peaks (right) on poly-A+-enriched RNAs from STM2457-treated MOLM-13 cells. b, The distribution of all (red) or downregulated (light blue) m6A peaks of MOLM-13 cells upon treatment with STM2457. c, Motif analysis of the sequences under depleted peaks following treatment with STM2457 (hypergeometric test). d, Genomic visualization of the normalized m6A-meRIP signal for SP1, MYC and HOXA10 in MOLM-13 cells following treatment with vehicle or STM2457. e, Polysome fractionation analysis in MOLM-13 cells treated with vehicle or STM2457. Absorbance was continuously measured at 254 nm. f, Quantification by qPCR with reverse transcription (RT–qPCR) of SP1, BRD4 and DICER1 mRNAs in each polysome fraction (high and low molecular mass), presented as a percentage of total mRNA. Data are mean ± s.d., n = 3. g, RT–qPCR quantification of SP1 and BRD4 in total RNA samples isolated from MOLM-13 cells treated with vehicle or STM2457. Data are mean ± s.d., n = 3. Two-tailed Student’s t-test; *P < 0.05. UTR, untranslated region; CPG, CPG island; TSS, transcription start site; CDS, coding sequence.

为了研究其抗白血病潜能，研究者们检测了一组STM2457处理后人类AML细胞系的增殖，并检测到浓度依赖的方式显著生长减少(图2a)，而STM2457并不影响正常的人脐带血CD34+细胞的集落形成能力(扩展数据图3a)。研究者们也没有观察到对照小分子STM2120对MOLM-13细胞增殖的影响，这与研究者们对STM2457细胞的观察结果相反(扩展数据图3b)。此外，STM2457治疗显著降低了原代小鼠AML细胞的克隆潜能(图2b)。但对正常的造血干细胞和祖细胞没有影响。(图2c)在MOLM-13和原代小鼠AML细胞中，METTL3的药理抑制也导致了显著的髓系分化和细胞周期阻滞(图2d，e)。相比之下，研究者们没有观察到与非白血病造血细胞系HPC7类似的作用(图3e-3d)。此外，STM2457治疗可诱导人和小鼠AML模型的细胞凋亡，但在正常的非白血病造血细胞中没有诱导作用(图2f)为了评估METTL3的药理抑制对SP16、12和BRD4的影响，两种已知的METTL3酶底物，研究者们用STM2457处理MOLM-13细胞，并观察到SP1和BRD4蛋白水平的剂量依赖性降低(图2g)。值得注意的是，SP1的异位表达显著降低了MOLM-13细胞对STM2457的敏感性(扩展数据图3f，g)。

4. STM2457可防止AML的扩增，并减少体内白血病关键干细胞的数量

Fig. 4| STM2457 prevents AML expansion and reduces the number of key leukaemia stemcells in vivo. a, Bioluminescence imaging of AML PDX-1mice (NPM1c cells) treated with vehicle or 50mg kg-1 STM2457 (n = 5). b, Kaplan– Meier survival curves of AMLPDX-1 mice after treatment with vehicle or 50 mg kg-1 STM2457 at indicatedtimes (n = 5). c, Bioluminescence imaging ofAML PDX-2 mice (MLL-AF6 cells) treated with vehicle or 50mg kg-1 STM2457 (n = 5). d, Kaplan–Meier survival curves ofAML PDX-2 mice after treatment with vehicleor 50 mg kg-1 STM2457 at indicated times (n = 5). e, Percentage of cellsexpressing human CD45 (hCD45) inbone marrow and spleen of PDX-2 mice aftertreatment with vehicle or 50 mg kg-1 STM2457 (n = 5). f, Percentage of CD93+ cells among CD38-CD34+ cellsin bone marrow after treatment with vehicle or 50 mg kg-1 STM2457 (n = 5). g, Kaplan–Meier survival curves ofAML PDX-2 miceafter re-transplantation of MLL-AF6 cells. Mice were treated withvehicle or 50 mg kg-1 STM2457 atindicated times (n = 5). Treatment (in red) andsolid lines in red or black referto the primary transplantation shown in d. h, Percentage of cells expressinghuman CD45 in peripheral blood after re-transplantationof MLL-AF6 cells from AML PDX-2 mice (n = 5) as described in g. PBCs, peripheral blood cells.Two-tailed Student’s t-test; log-rank (Mantel–Cox) test was used forsurvival comparisons.

数据表明，METTL3的催化功能对白血病的生长很重要，这与之前的研究结果一致。接下来，研究者们试图研究STM2457影响AML的分子机制。对STM2457处理后的MOLM-13细胞进行RNA测序分析，发现1338个基因上调，489个基因下调(扩展数据图4a）。对差异表达基因的基因本体论(GO)分析显示，在与髓系分化、细胞周期和白血病进展相关的通路中富集(扩展数据图4b，c)，与研究者们的表型观察结果密切一致。为了检测METTL3的抑制对m6A水平的影响，研究者们在STM2457处理的MOLM-13细胞中进行了m6A特异性甲基化RNA免疫沉淀(m6A-meRIP-seq)。在poly-A+富集的RNA上发现了11909m6A峰，其中4666个在STM2457处理后减少，表明它们依赖于METTL3的催化活性。研究者们观察到一般m6A分布与STM2457处理后的分布之间没有重大变化(图3a-3b)。经STM2457处理后，通过基序分析，确定m6a相关的DRACH基序16为最高的候选底物序列(图3c)，验证STM2457治疗的特异性。

接下来，研究者们将m6A-meRIP-seq结果与来自MOLM-13细胞的meRIP-seq数据集进行了比较，该数据集中METTL3的表达已被敲除。研究者们发现在差异m6a甲基化的聚a+RNA以及差异m6a峰上有大量的重叠(扩展数据图5a-5b)，包括许多已知和以前未知的mettl3特异性m6a底物(图3d)。观察到的底物和峰的差异可能是由于STMETTL3敲低相比，METT457对METTL3有更具体的催化抑制，这可能会破坏整个m6A甲基转移酶复合物。m6A-meRIP和定量PCR(qPCR)验证显示，STM2457处理导致MeTTL3依赖的核心白血病生成m6A底物中的m6A水平，包括HOXA1018和MYC19中的m6A水平降低，而在meTTL3不依赖的m6A底物中没有观察到差异(扩展数据图。5d)，从而验证了研究者们的m6A图谱的特异性。对差异m6A-meRIP候选基因的GO分析显示，参与染色质修饰、DNA损伤和RNA剪接的通路富集(扩展数据图5e)的染色质机制，以及m6A与核生物过程的连接。先前已有研究表明，基因抑制METTL3和METTL14会导致mRNA翻译缺陷和核糖体停滞。因此，研究者们研究了分离的METTL3催化抑制是否会导致类似的翻译缺陷。多聚体分析显示，用STM2457处理MOLM-13细胞后，高多聚体组分丢失(图3e)。使用qPCR对多聚体组分的验证表明，高分子量组分中已知的mettl3依赖的底物显著减少，低分子量组分显著增加，表明核糖体停滞(图3f)。相比之下，DICER1，一种mettl3独立的m6a底物，不受STM2457处理的影响(图3f)。至关重要的是，METTL3生物标志物BRD4和SP1的整体RNA表达水平没有变化。而蛋白质水平则大大降低。验证对mRNA的影响是在翻译水平，而不是在转录水平。此外，STM2457处理维持了METTL3和DICER1的表达水平(扩展数据图5f)以及METTL3、METTL14、DDX3X和DICER1的蛋白水平(扩展数据图5g)，进一步表明其对mRNA翻译的影响不是全局的，而是特异性的。综上所述，该机制分析表明，METTL3的催化抑制会导致基因表达缺陷，这与对m6A底物的mRNA翻译效率的影响相一致。

在体外发现METTL3具有强药理抑制作用的积极证据后，研究者们使用临床相关的AML模型进行了体内研究。最初，研究者们使用了三种不同基因型的人类AML患者来源的异种移植物(PDX)。每日使用STM2457治疗可导致体内移植受损和AML扩增，并显著延长了小鼠的寿命(图4a-d)。对小鼠体重没有明显的毒性或影响(扩展数据图6f)。治疗后，人骨髓和脾脏中的CD45+细胞的减少也证实了抗白血病作用(图4e)。STM2457在体内有效抑制METTL3靶点是通过在蛋白水平上选择性降低关键的m6A底物，而METTL3水平保持不变(扩展数据图6g)。此外，在使用STM2457处理后，poly-A+富集RNA上的总m6A水平显著降低(扩展数据图6h)。与PDX模型，研究者们使用一个主要小鼠MLL-AF9/Flt3Itd/+体内模型，与类似的抗白血病观察与减少移植AML细胞，减少脾脏大小，选择性减少METTL3生物标志物和减少poly-A+富集RNA(扩展数据图7a–d)。

在建立了STM2457的体内抗白血病作用后，研究者们接下来研究了METTL3的药理抑制对重要白血病干细胞亚群的影响。CD93+和L-GMP亚群与MLL重排驱动的原代小鼠和人类患者AMLs的产生和维持直接相关。值得注意的是，研究者们观察到，用STM2457处理后，CD93+和L-GMP群体显著减少，表明其对METTL3的催化功能有很强的依赖性(图4f)。此外，经STM2457处理后，CD48+的强度增加(扩展数据图。7g)，表明白血病干细胞水平上的自我更新缺失，这与研究者们的体外和体外观察结果一致。为了证明METTL3抑制会导致白血病干细胞的功能损伤，研究者们使用经载体或STM2457处理的原代移植细胞中的小鼠或患者来源的AML细胞进行了再移植实验。研究者们观察到，仅在STM2457初始治疗后，外周血中患者的寿命显著增加，而外周血中AML细胞的存在显著减少(图4g-4h)。综上所述，体内METTL3的药理抑制通过影响AML干细胞或白血病传播来损害AML的扩张。

结论：

研究者们评估了已建立的抗白血病剂量的STM2457在体内的潜在毒性。骨髓源性造血干细胞和早期祖细胞(Lin−SCA1+KIT+)的数量、小鼠外周血计数或体重均未观察到显著变化(扩展数据图8a–e)。研究者们还证实了METTL3的有效催化抑制作用，因为在STM2457处理后，poly-A+富集RNA上的m6A水平显著降低(扩展数据图8f)。这些数据表明，小分子抑制METTL3对AML的维持有害，但对正常造血没有显著或持久的影响。在这篇文章中，研究者们已经描述了STM2457，一种m6A作用METTL3的生物可利用抑制剂。研究者们已经证明，STM2457催化抑制METTL3靶向AML的关键干细胞群，逆转AML表型，阻止或减缓AML的发展。因此，研究者们的研究结果为靶向导致AML持续和复发的白血病干细胞亚群提供了一种很有前途的策略，并为未来研究METTL3与主流抗AML治疗的联合研究提供了理论基础。总的来说，研究者们的努力进一步强调了m6A“劫持”对AML状态的影响。据研究者们所知，这是首次证明了RNA甲基转移酶抑制剂对癌症的体内活性和治疗效果。