吸烟不但伤肺，还可能会伤 “菊花”——Gut报道吸烟会导致肠道微生物群生态失调从而引发结直肠癌

结直肠癌是目前最常见的癌症之一，占比为11%。每100,000人发病率为19.7，且发病率呈逐年上升的趋势。虽然有许多早期结直肠癌筛查和预防的策略，但是如何“护菊”仍然是人们常常关注的话题。

众所周知，吸烟会增加患肺癌的风险。其实，吸烟还会增加其他不直接接触香烟烟雾的器官患癌症的风险，如结肠、直肠、胰腺和肾脏。之前的研究表明，吸烟与结直肠癌的发病率和死亡率显著相关，但是其中的机制尚不清楚。近日，香港中文大学研究报道揭示了其中的机制，吸烟可通过诱导肠道微生物群生态失调，从而促进结直肠癌发生发展。

吸烟可促进小鼠结直肠癌的发生

为了研究吸烟对结直肠癌发生的影响，研究者用偶氮甲烷对C57BL/6小鼠进行结直肠癌的诱导，然后将小鼠分别暴露于清洁的空气中或香烟烟雾中（图1A）。结果发现，吸烟组小鼠的结直肠肿瘤的数量和大小显著大于非吸烟组小鼠（图1B）。显微镜组织学检查显示存在结肠腺瘤和腺癌（图1C）。同时，吸烟组的小鼠的结肠肿瘤发病率显著增加（图1D）。与非吸烟组小鼠相比，吸烟组小鼠结肠上皮细胞增殖增加，表明Ki-67阳性细胞数量和增殖细胞核抗原（PCNA）表达水平显著性增高（图1E、F）。

图1 吸烟可促进小鼠结直肠癌的发生

吸烟可改变小鼠肠道微生物群组成和微生物相互作用

为了研究吸烟组与非吸烟组小鼠的肠道微生物群的差异，研究者对其粪便进行了鸟枪法宏基因组测序分析。基线时，两组小鼠在α和β多样性方面没有显著性差异，28周后吸烟组小鼠的α多样性显著性降低（图2A）。PCoA分析显示，吸烟组的β多样性也显著性降低（图2B）。其中，有20种肠道细菌发生了明显改变（图2C），包括E. lenta（PCR定量 图2D）和Staphylococcus capitis含量上升、Lactobacillus reuteri、Parabacteroides distasonis和Bacteroides dorei含量下降。

图2 吸烟可改变小鼠肠道微生物群组成和微生物相互作用

研究者还观察到细菌之间的生态网络在两组小鼠之间丰度存在差异（图2E）。同时，两组小鼠的肠道细菌之间的共生和互斥相关作用明显不同，如E. lenta与Lactobacillus jensenii、Lactobacillus crispatus的互斥性，表明E. lenta与吸烟组小鼠保护性细菌的拮抗性相关（图2D）。

吸烟可改变粪便中与肠道微生物群相关的代谢物

为了测定吸烟后粪便代谢物的改变，研究者利用HPLC-MS分析了小鼠的粪便。正交偏最小二乘判别分析显示，吸烟组小鼠的粪便代谢谱与非吸烟组小鼠显著不同（图3A）。其中，有41种代谢物发生改变（图3B）。发生改变的代谢物在不同的代谢组学信号通路种富集或耗尽（图3C）。吸烟组小鼠的胆汁酸生物合成是富集途径最高的。在肠道中，细菌将原代胆汁酸转化为次级胆汁酸，其中部分胆汁酸被末端回肠和结肠吸收。在这些次级胆汁酸中，已知TDCA是促进肿瘤的发生发展的。TDCA的丰度在吸烟组小鼠中显著性增加（图3B）。通过MS进一步证实吸烟组小鼠粪便TDCA明显升高（图3D）。

为了确定微生物群与代谢物的潜在关系，研究者通过Spearman进行细菌和代谢物之间的相关性分析。研究者观察到吸烟组小鼠E. lenta与TDCA具有正相关，而L. jensenii和L. crispatus与TDCA呈负相关（图3E）。E. lenta具有去初级胆汁酸结合能力，并表达胆汁酸差聚酶3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-HSDH），参与次级胆汁酸合成并影响粪便中TDCA水平。结果还发现，吸烟组小鼠编码3β-HSDH酶基因丰度明显更高。进一步研究证实E. lenta丰度与粪便中TDCA浓度呈正相关（图3F）。因此，肠道微生物生态失调和改变的代谢物可能共同作用，促进结肠肿瘤的发生。

图3 吸烟可改变粪便中与肠道微生物群相关的代谢物

吸烟损害肠道屏障功能

为了研究吸烟对肠道屏障功能的影响，研究者分析了结肠紧密连接蛋白，claudin-3和ZO-1和血清脂多糖（LPS）水平。蛋白质印迹和免疫荧光染色显示吸烟显著降低claudin-3和ZO-1水平（图4A、B）。电子显微镜检查进一步证实了损伤的紧密连接（图4C）。同时，发现吸烟组小鼠的血清LPS水平显著增加（图4D）。这些结果共同表明，吸烟会导致肠道屏障功能受损。

图4 吸烟损害肠道屏障功能

吸烟增强结肠上皮细胞致癌的MAPK/ERK信号传导

研究者还分析了结肠上皮细胞中癌症相关基因表达。与非吸烟组小鼠相比，吸烟组小鼠可观察到19个上调基因和7个下调基因（图5A）。富集分析表明，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路是吸烟激活的通路（图5B）。先前研究报告称，TDCA可激活MAPK通路的ERK家族，研究者发现吸烟组小鼠结肠上皮的MAPK/ERK激活。通过吸烟激活MAPK/ERK信号传导通过磷酸化ERK1/2水平升高证实，磷酸化ERK1/2是MAPK/ERK途径的关键介质蛋白（图5C）。这些发现表明，吸烟诱导ERK1/2磷酸化并激活MAPKI/ERK信号通路以促进结肠肿瘤发生。

图5 吸烟增加结肠上皮细胞致癌的MAPK/ERK信号传导

吸烟增强促炎信号基因的表达

肠道细菌生态失调与验证密切相关，因此研究者对小鼠的促炎基因表达进行了PCR分析。与非吸烟组小鼠相比，吸烟组小鼠有27个上调基因和5个下调基因（图5D）。吸烟诱导IL-17和TNF信号通路。RT-PCR证实，吸烟组小鼠的促炎性基因II-17a、Cxcl2表达增加，抗II-10表达降低（图5F）。此外，II-17a相对mRNA表达与结肠中E. lenta丰度呈正相关。这些发现表明，吸烟会促进结肠肿瘤发生的炎症。

对无菌小鼠进行吸烟组小鼠的粪便微生物移植发现肠道微生物群的改变

为了证实吸烟改变肠道微生物群对结直肠癌的直接作用，研究者对对无菌小鼠进行两组小鼠的粪便微生物群移植。对无菌小鼠20周后的粪便微生物进行分析，接受吸烟组小鼠粪便移植的α多样性显著性降低（图6B），β多样性也有明显的差异性（图6C）。进一步分析显示接受吸烟组小鼠粪便移植的有34个细菌有差异性（图6D），E. lenta丰度显著性增加，P. distasonis丰度显著性降低（图6E）。

图6 对无菌小鼠进行吸烟组小鼠的粪便微生物移植发现肠道微生物群的改变

吸烟通过改变微生物群促进无菌小鼠的结肠细胞增殖和肿瘤发生

与接受非吸烟组小鼠粪便移植的相比，接受吸烟组小鼠粪便移植的无菌小鼠结肠上皮细胞增殖增加，其表现为Ki-67阳性细胞比例和PCNA表达水平更高（图7A、B），同时结肠肿瘤数量和肿瘤大小也更高。这些结果与普通小鼠观察的结果一致，表明吸烟改变微生物群和代谢组可以直接促进结肠细胞增殖和肿瘤生长。

图7 吸烟通过改变微生物群促进无菌小鼠的结肠细胞增殖和肿瘤发生

吸烟改变微生物群会损伤无菌小鼠的肠道屏障功能

研究者发现接受吸烟组小鼠粪便移植的无菌小鼠的claudin-3和ZO-1表达降低，血清LSP水平升高（图7C、D）。显微电子镜观察发现顶端连接复合物中的细胞间连接和结肠中的细胞旁间隙增宽（图7E）。因此，吸烟对微生物群和代谢组的改变可能会损害肠道屏障功能，可能进一步促进肿瘤生长。

吸烟改变微生物群增强无菌小鼠结肠上皮中的致癌MAPK/ERK途径

研究者发现接受吸烟组小鼠粪便移植的无菌小鼠有9个上调基因和3个下调基因（图7F），主要集中在MAPK/ERK信号通路中。同时，接受吸烟组小鼠粪便移植的无菌小鼠ERK1/2磷酸化蛋白表达升高证实了MAPK/ERK信号传导的激活（图7G）。还可以发现该无菌小鼠的16个促炎基因发生上调，这些基因主要在TNF和IL-17信号通路中富集（图7I、J）。定量RT-PCR证明TNF和IL-17途径的关键促炎基因，包括II-17a、Cxcl2、Cxcr2发生上调（图7K）。这些结果表明，吸烟通过改变改变肠道微生物群促进结直肠癌的发生。

结论

吸烟可通过诱导肠道微生物群生态失调从而促进结直肠癌的发生发展。该研究揭示了吸烟引发结直肠癌的机制。与非吸烟组小鼠相比，吸烟组小鼠的肿瘤发病率和细胞增殖显著增加。吸烟组小鼠可观察到肠道微生物生态失调，其细菌种类丰度有显著差异。其代谢组学分析显示胆汁酸代谢物增加。同时，吸烟组小鼠表现出增强的致癌MAPK/ERK信号传导和肠道屏障受损。因此，吸烟不仅伤害肺部组织，还会伤害“菊花”引发结直肠癌，所以珍爱健康，远离吸烟。

参考文献

Bai X, Wei H, Liu W, et al. Cigarette smoke promotes colorectal cancer through modulation of gut microbiota and related metabolites [published online ahead of print, 2022 Apr 6]. Gut. 2022;gutjnl-2021-325021. doi:10.1136/gutjnl-2021-325021