Calcein (Fluorexon)

本实验方案以使用Calcein (Fluorexon)渗漏试验来测试离子载体对膜完整性^[4]为例，仅提供实验指导，实际应用须根据您的实际需求进行修改。

一、材料准备：

1. 缓冲液A（200mL）

a. 取4mL 0.5M HEPES （pH 7.4，10mM）与60mL 0.5M KCl（150mM）混合。

b. 加入100mL去离子水，用KOH调节pH至7.4。

c. 使用去离子水将溶液定容至200mL，并用0.22µM微孔滤膜过滤除菌。

2. Calcein (Fluorexon)储备（16.6mM，1mL）

a. 将10.334mg Calcein (Fluorexon)溶解于缓冲液A中，使终体积为1mL，涡旋混匀。

b. 用铝箔覆盖管子，以保护其储备液免受日光照射。

3. CuCl₂ 储存液（2mM）

a. 将110.98 mg CuCl₂溶解于去离子水中，使成最终体积为1mL，以获得1M CuCl₂。

b. 然后，将2µL 1M CuCl₂ 加入998µL去离子水中使成储存液。

4. G50-凝胶

a. 将2.5g Sephadex G-50 加入50mL缓冲液A中，通过混合使其溶解。

b. 凝胶必须在室温下膨胀，然后储存在4℃中。

5. HEPES（pH 7.4，0.5M，200mL）

a. 将9.532g HEPES 溶解于去离子水中，使终体积为170mL。

b. 用1M KOH调整pH至7.4，然后用去离子水补充至200mL。

6. 离子载体储备液（6mM）

a. 准备10mg 4-Br-A23187的初始原料，溶解于1mL的二甲基亚砜（DMSO）中。

b. 浓度达到6mM 1-Br-A23187后，将36.15µL的储备溶液与63.85µL的过滤灭菌DMSO混匀稀释，使最终体积为100µL。

c. 实验前，使用0.22μM微孔滤膜对DMSO进行过滤灭菌。

7. 氯化钾（0.5M，200mL）

a. 将7.455g KCl溶解于去离子水中，最终体积为200mL。

8. 氢氧化钾（1M）

a. 将5.611g KOH 溶解于去离子水中，最终体积为100mL。

9. 氯仿中的脂质原料

a. 将脂质以25mg/L的浓度存放在氯仿中，并储存在-20℃下直至进一步使用。对于更长时间的储存，蒸发氯仿并将干燥的脂质储存在-20℃。在使用前，将25mg脂质溶解在1mL的氯仿：甲醇溶液（v:v）中。

注意：某些脂质可能在氯仿：甲醇中的溶解度有限或非常差，需要则需氯仿：甲醇：水的混合物溶解

10. 取18.07µL的16.6mM Calcein (Fluorexon)储备液（最终浓度为300µM），用缓冲液A加至最终体积为1mL。用铝箔覆盖管子。

11. Triton 100-X solution (20% w/v)

a. 取200mg Triton溶解于1mL去离子水中。

二、实验流程

A. 脂质薄膜的制备

1. 用氯仿：甲醇（1:1，v:v）在通风柜下冲洗汉密尔顿注射器五次。

注意：氯仿是一种有害溶剂。所有工作应在通风橱内进行，并佩戴适当的个人防护装备。

2. 使用汉密尔顿注射器，将200µL的25mg/mL DOPC储备溶液（见配方9）转移到放置在冰上的圆底玻璃管中，（见图1）。

注意：处理有机溶剂时，避免使用塑料制品。

图 1. 脂肪薄膜制备方案。（A）将所需量的脂质（I）转移到玻璃管中。随后，在250mbar的减压下，在旋转蒸发器中过夜（ON）蒸发溶剂，导致玻璃管侧面形成一层薄薄的脂质薄膜（II）。（B）含有氯仿中所需脂质的玻璃管连接到旋转蒸发器。

3. 将有机溶剂置于室温下，并于旋转蒸发仪中减压至250mbar过夜蒸发，然后在大约10mbar下蒸发15分钟。

4. 干脂膜可储存在-20℃。

B. 含Calcein (Fluorexon)的大单层脂质体（large unilamellar vesicles；LUV）制备

1. 向脂质膜中加入1mL终浓度的Calcein (Fluorexon)储备液和一颗3mm的玻璃珠。涡旋10分（见图 2A）。

2. 将脂质悬浮液转移到新的玻璃管中，弃去玻璃珠。

3. 将脂质悬浮液进行五次冻融循环，通过将试管交替放入液氮中冷冻10分钟，然后在50℃的水浴中解冻5分钟。

注意：处理液氮时请佩戴面罩和绝缘手套。使用耐高温冲击的玻璃管。

4. 组装微型挤出机，由两个Hamilton玻璃注射器和一根带有两个排液盘的特氟龙圆柱体以及它们之间夹着的200nm酸酯膜组成(见图 2B)。

注意：我们通常使用200nm的聚碳酸酯膜，并在室温下进行挤出。然而，对于含有饱和、长链脂肪酸的脂质，这些脂质具有高的脂质相变温度（T_m），挤出机需要加热至比T_m高5-10℃的温度。这种温度在不同脂质配方之间可能差异很大。

5. 检查微型挤出机的紧密度，通过用1mL缓冲液A冲洗，即通过注射器往返三次至四次。只有在每次通过时缓冲液体积保持相同的情况下才继续。

6．将一个汉密尔顿玻璃注射器充满约1mL的脂质/ Calcein (Fluorexon)溶液，并将充满的注射器放入微型挤出机的一端。

7. 小心地将空注射器放入迷你挤出机的另一端。空注射器的活塞应完全压入注射器筒内。

8. 将脂质悬浮液通过过滤器至少挤出11次，从注射器1开始，到注射器2结束。

注意：通过挤出机的通道次数需要是不均匀的，以便最终收集到的不受未通过挤出机的残留多层囊泡污染的脂质体样品在注射器2中。

9. 将最终脂质溶液注入1.5mL微量离心管中，并储存在4℃。

注意：结果脂质体的粒径分布可以通过动态光散射进行评估。当使用200nm孔径的聚碳酸酯膜时，我们通常获得一个水动力直径在168.5±2.5nm范围内的制备物。

10. 立即用Milli-Q水清洗挤出机的所有部件，然后用70%乙醇清洗，彻底干燥后再储存。储存前用溶剂冲洗注射器。当挤出额外的囊泡时，拆卸并清洗挤出机的所有部件，并更换膜和过滤器支架。

图 2.制备载有Calcein (Fluorexon)的LUV的方案。（A） 在含有荧光染料Calcein (Fluorexon)的上样缓冲液（步骤I）中涡旋10分钟（步骤II），将干燥的脂质膜水合。脂质悬浮液（步骤III）使用液氮（-196℃，步骤IV）和50℃的水浴（步骤V）进行五次冻融循环。接下来，将悬浮液通过安装在微型挤出机中的0.2μM核孔聚碳酸酯膜11次以形成LUV（步骤VI）。（B） 微型挤出机的组装。使用四个过滤器支架，每侧两个。使用两个聚碳酸酯膜，空白面彼此朝向。

C. 分离Calcein负载的LUV与游离染料

1. 准备两根G50柱子，使用无活塞的2mL塑料注射器，以过滤器支架作为塞(见图3A)。

2. 将注射器放入可丢弃的15mL反应管中，使用移液管加入3Ml Sephadex G50细悬浮，以 180×g离心5分钟，然后将柱子转移到新的15mL反应管中。

3. 将样本加载到G50柱子顶部。

4. 离心机以180×g和室温下运行5分钟(见图3B）。

5. 将洗脱液转移到第二个G50柱的顶部。

6. 再次以180×g和室温离心5分钟。

注意：如果未实现将游离染料（柱的强烈黄色部分）与囊泡（柱的无色下部）分离，请用新的 G50 柱重复洗脱液的尺寸排阻色谱（见图 3C）。

7. 收集含有Calcein (Fluorexon)的洗脱液于新的15mL Falcon管中。

8. 用铝箔覆盖管子。

注意：负载Calcein (Fluorexon)的LUV可以在黑暗 4℃储存至次日。

图 3. 通过尺寸排阻色谱法分离负载Calcein (Fluorexon)的脂质体。 (A) 对于尺寸排阻色谱法，将两个滤网支架放置在无芯杆的3mL塑料注射器中作为塞子，并加入3mL的 Sephadex G50 细悬浮液。 (B) 在尺寸排阻色谱过程中，负载Calcein (Fluorexon)的脂质体与游离Calcein (Fluorexon)分离。脂质体会随着早期洗脱液中的空白体积洗脱，而非脂质体结合的Calcein (Fluorexon)将在后期洗脱液中洗脱。 (C) 显示经过捕获游离Calcein (Fluorexon)后的G50过滤柱的图像。游离Calcein (Fluorexon)位于第一次分离后的第一个G50过滤柱中。在下次分离后，第二个G50过滤柱中不含游离Calcein (Fluorexon)。

D. 监测膜离子通透性

1. 将缓冲液、比色皿和载有Calcein (Fluorexon)的LUV冷却至10℃（例如，存放在10℃的冰箱中）。

注意：在缺乏离子载体的情况下，为了抑制非催化运输速率，该试验在10℃下进行。其他脂质组成的脂质体制剂可能表现出较低的被动渗透性，从而允许更高的试验温度。

2. 打开荧光计并设置以下参数：激发波长480nm，发射波长520nm，测量时间约10分钟，1秒分辨率。根据需要调整狭缝；通常3nm的通带就足够了。

3. 将荧光计的样品夹冷却至10℃。

注意：我们在测量过程中使用基于珀尔帖效应的温度控制以及磁力搅拌，提供温度稳定性和全控制软件。

4. 向荧光计小室中加入20µL的Calcein (Fluorexon)负载的LUV，并用预冷的缓冲液加至2mL。

a. 为探究离子载体对离子通透性的影响，向比色杯中加入1µL的离子载体（参见配方6，最终浓度3µM），并在冰箱中进一步孵育5分钟。

b. 作为存在离子时淬灭Calcein (Fluorexon)的对照，通过向比色杯中加入10-20µL的20% Triton X-100（见配方11）制备一个样品，并在冰箱中孵育5分钟。

5. 将比色杯放入荧光计中（记得包括磁力搅拌棒），并开始监测发射强度。

6. 等待荧光稳定（90秒）。

7. 测量荧光强度。1.5分钟后，加入3µM CuCl₂（3µL的2mMCuCl₂，参见配方3），并记录荧光另外8.5分钟。

注意：为确保您的设置和加Calcein (Fluorexon)的LUV正常工作，请在测量开始时从450nm至500nm（发射520nm）运行激发扫描，并从500nm至550nm（激发480nm）运行发射扫描。对于Calcein (Fluorexon)，激发和发射最大值应分别位于480nm和520nm。

8. 仪器导出数据后分析。

References:

[1]. Allen T M, Cleland L G. Serum-induced leakage of liposome contents[J]. Biochimica et biophysica acta (BBA)-biomembranes, 1980, 597(2): 418-426.

[2]. Tsao Y S, Huang L. Sendai virus induced leakage of liposomes containing gangliosides[J]. Biochemistry, 1985, 24(5): 1092-1098.

[3]. Patel H, Tscheka C, Heerklotz H. Characterizing vesicle leakage by fluorescence lifetime measurements[J]. Soft Matter, 2009, 5(15): 2849-2851.

[4]. Uzun H D, Vázquez-Hernández M, Bandow J E, et al. In vitro Assay to Evaluate Cation Transport of Ionophores[J]. Bio-protocol, 2022, 12(22): e4552-e4552.