Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Plus

本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。

细胞数量确定
1. 将细胞悬浮液（100μL/孔）接种在96洞孔板中。将板在潮湿的培养箱中预孵育（例如，在37℃，5％CO₂下）。
2. 向板的每个孔中加入10μL CCK8溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰O.D.读数。
3. 将板子放入培养箱中孵育0.5 - 1小时。
注意：与普通版CCK-8（货号GK10001）相比，本试剂盒经过优化，灵敏度更高。建议在0.5 - 1小时内完成检测。如果细胞生长太慢，可将孵育时间延长至3小时。
4. 使用酶标仪测量450nm处的吸光度。

细胞增殖和细胞毒性测定
1. 将种子细胞以10³-10⁴个细胞/孔的密度在96孔板中在100μL培养基中培养。将细胞在CO₂培养箱中于37℃培养24小时。
2. 将不同浓度的待测物质加入板中。
3. 将培养板在培养箱中孵育适当的时间（例如，6,12，24或48小时）。
4. 使用重复移液器向板的每个孔中加入10μL CCK8溶液。注意不要在孔洞中引入气泡，因为它们会干扰O.D.读数。
5. 将培养板在培养箱中孵育0.5 - 1小时。
注意：与普通版CCK-8（货号GK10001）相比，本试剂盒经过优化，灵敏度更高。建议在0.5 - 1小时内完成检测。如果细胞生长太慢，可将孵育时间延长至3小时。
6. 在读取孔板之前，重要的是在轨道振动器上轻轻混合1分钟，以确保颜色均匀分布。
7. 使用酶标仪测量450nm处的吸光度。

数据分析
统计分析有几种方法，您可以选择使用O.D.值或细胞数量，我们提供其中一种方法。
细胞存活率（％）= [（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100
抑制率（％）= [（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100
As =实验孔吸光度（含有细胞，培养基，CCK-8和待测化合物的孔的吸光度）。
Ab =空白孔吸光度（含有培养基和CCK-8的孔的吸光度）。
Ac =对照孔吸光度（含有细胞，培养基和CCK-8的孔的吸光度）。

制作标准曲线
1. 细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数。
2. 使用培养基，等比稀释细胞悬液为一个浓度梯度，通常需要5-7个浓度梯度，每组几个复孔。然后接种细胞。（注意每孔的细胞数量。如果您将细胞悬液稀释在管中，在加入培养板的孔之前，请小心再次混匀细胞。每孔中细胞悬液的体积应该是一致的。）
3. 培养直至细胞贴壁（通常2-4小时），然后每100μl培养基加入10μl CCK-8。继续孵育0.5-1小时，用酶标仪测量450nm处的吸光度。制作出一条以细胞数为X轴坐标，O.D.值为Y轴坐标的标准曲线。
可以基于该曲线确定待测样品的细胞数。使用此标准曲线的先决条件是培养检测条件相同。

注意事项
1. 确保药物和CCK8均匀分布在培养基中。
2. 细胞增殖越多，颜色越深；细胞毒性越强，颜色越浅。
3. 对于贴壁细胞，每孔至少需要1000个细胞（100μl培养基）。对于白细胞，由于灵敏度较低，每孔至少需要2500个细胞（100μl培养基）。推荐的96孔板每孔最大细胞数为25000。如果使用24孔或6孔板进行该检测，请计算相应的每孔的细胞数，并调整CCK-8的体积，使其为每孔总液体体积的10％。
4. 因为CCK8测定是基于活细胞中的脱氢酶活性，影响脱氢酶活性的条件或化学物质可能导致实际活细胞数与使用CCK-8测定活细胞数之间有差异。
5. WST-8可能与还原剂反应生成WST-8 formazan。如果使用还原剂（例如一些抗氧化剂）会干扰检测。如果待检测体系中存在较多的还原剂，需设法去除。
6. 孵育2小时后，背景O.D.值一般为0.1-0.2单位。
7. 注意不要在孔中引入气泡，因为它们会干扰O.D.值。
8. 如果您想对CCK8溶液进行灭菌，请使用0.2μm的膜过滤溶液。
9. 如果细胞悬液中存在高浊度，测量并减去样品在600nm或更高波长的O.D值。
10. CCK8不能用于细胞染色。
11. 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。
12. CCK8的毒性非常低，在CCK8测定完成后，相同的细胞可用于其他细胞增殖测定，例如结晶紫测定，中性红测定或DNA荧光测定。（除非细胞极为稀少，不推荐。）
13. 该试剂盒可用于大肠杆菌，但不能用于酵母细胞。
14. 在读取平板之前，您可以在摇床上轻柔混匀。
15. 我们建议将细胞接种在靠近培养板中央的孔中，最外围一圈孔中的培养基容易蒸发，可以用PBS，水或培养基填充这些孔。
16. 如果您没有450nm滤光片。您也可以使用吸光度在430和490nm之间的滤光片，450nm滤光片具有最佳灵敏度。
17. 测量450nm处的吸光度，如果您需要进行双波长测定，作为参考波长可以测定650nm处的吸光度。
18. 药物中金属离子的存在可能会影响CCK8的灵敏度。终浓度为1mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM的话，将会100%抑制。

常见问题：
Q：如何做空白对照？
A：可以用加相应量细胞培养基和CCK-8但不加细胞的孔作为空白对照，若担心所使用的药物会干扰检测，需设置加相应量细胞培养液、药物和CCK-8但不加细胞的孔作为空白对照。

Q：只加CCK-8不加细胞的空白孔，数值上增？
A：在整个实验过程中，随着时间的增加，如果细胞培养时间较长，请注意蒸发问题。因为反应环境温度较高，会有部分液体挥发。空白组虽然没有细胞，但是随着液体的挥发，药物浓度相当于提高了，所以空白对照的数值也会有轻微的变化（但不会有明显的变化）。如果很在意空白对照的数值，可将96孔板外围一圈加培养基、水或PBS保湿。同时，可以把96孔板置于培养箱内靠近水盘的位置以缓解蒸发。将96孔板外围两圈用PBS铺板，这样挥发先挥发周边的，可以对内部及空白对照的影响降至最低。

Q：一般多久测一次值？
A：预实验时可以在0.5和1小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。如果细胞生长太慢，可将孵育时间延长至3小时。

Q：加入CCK8后暂时不测OD值，可以如何处理暂时保存？能够保存多久？
A：如果需要暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10ul 0.1M HCl溶液或者1% w/v的SDS溶液，避光保存在室温，24小时内吸光度不会发生变化。

Q：如何保存？
A：CCK-8溶液在避光、0-5℃的条件下可以保存1年，若长期不用可在-20℃下避光保存2年。建议分装后保存于-20℃，使用时提前于4℃解冻，请避免反复冻融，否则增加背景值，干扰实验结果。

Q：是否需要更换培养基？
A：不需要，若药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

Q：待测物质有氧化性或还原性该做何处理？
A：本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待测物质有氧化性或还原性，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。
如果实验中有还原剂，请检查背景的OD值，即在不含细胞的培养基中加入药物，然后加入CCK-8试剂在一定时间内检测，和不加药物的培养基进行比较（只有CCK-8试剂），如果O.D值明显偏高，则说明有反应。

Q：如果培养基颜色或PH已变化，是否需要更换新的培养基？
A：加入CCK-8时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或pH值已变化，建议换用新鲜的培养基。

Q：适用细胞？
A：因为测线粒体酶，所以真核细胞，有线粒体的均可，例如单细胞，动物细胞。但有细胞壁的细胞，例如植物细胞，酵母细胞，底物进入细胞效率低，不推荐。

Q：线性不佳原因？
A：细胞不均；培养液蒸发；还原剂；气泡；孔板周围一圈不能用，除非只培养少于一天的时间；细胞数目很重要，太少信号会低。

Q：金属毒性？
A：可以检测金属毒性，最好做空白对照。

Q：适用于那些细胞？其他还有哪些细胞可用？生物被膜内的活菌 (流感嗜血杆菌和绿脓杆菌)？
A：所有哺乳动物的细胞，细菌一般没有检测CCK8的，可以染色法，或者流式，最常规的方法，有报道，比浊法测OD600。

Q：是否可以替代Brud或EDU法检测细胞增殖？
A：虽然CCK8通过检测对生长期的细胞内的脱氢酶来反应细胞的活性，而胸腺嘧啶插入法通过核苷酸类似物的方式插入合成的DNA来检测细胞的活性，这几种方法是有一定关联性的，CCK8可替换胸腺嘧啶插入法来检测细胞增殖，并且检测更方便。

Q：空白孔数值偏高，有可能是培养基长菌吗？或者其他原因？
A：空白孔数值偏高一般认为染菌造成的，很少出现这种问题。

Q：CCK8能检测组织吗？
A：不能检测组织。

Q：是否可以检测T细胞？
A：可以，T细胞长的慢，需延长孵育时间。

Q：当两个细胞混合培养时（骨髓间充质细胞，另一个是悬浮T细胞），培养一段时间后，只测骨髓间充质干细胞的生长、增殖情况，请问用CCK-8能测吗？怎么做？
A：对于两种细胞的情况：
1）如果测定贴壁细胞的生长状况，那么可以把悬浮的T细胞转移掉，使用上述第二种方法测定。
2）如果T细胞对于间充质细胞的生长很关键，不能取走，那么测定的活性程度是总量，此时，需要对每一个孔的T细胞进行估算，如果每个培养条件下T细胞总量接近，或者T细胞含量很少，远远小于间充质细胞，也可以测定，使用对照孔可以去除T细胞的影响。
3）如果T细胞可以短时间内除去，可以使用本试剂盒，信号较强，建议细胞量合适的情况下（每一个孔10000个），30分钟左右出读数结果，测定后，可以将T细胞再加入培养孔。这样做对细胞的生长影响不大。但是如果做动力学，那么要考虑的因素多一些。

Q：CCK-8是通过和细胞内的脱氢酶反应而反映着细胞数量，假如细胞已经死亡，而脱氢酶活性还有，那么如何计算细胞数量？
A：多数情况下，细胞死亡过程中，细胞内的成分会降解，脱氢酶会有部分释放，但是活性和活细胞比，比较低。举例说：100个细胞死亡20小时后，释放的脱氢酶活力，不足5个活细胞的脱氢酶活力，也就是说，这种情况带来的误差5％以内。而且，这种细胞死亡，对同种细胞来说，情况是一样的，一般都是在不同的孔间比较同种细胞，所以系统误差是一样的，即系统误差会彼此消减。