Collagenase IA
(Synonyms: 骨胶原酶; 胶原蛋白水解酶) 目录号 : GC19593Collagenase IA是一种蛋白水解酶,常用于消化细胞外基质蛋白。Collagenase IA专一作用于原胶原,使其断裂进而被其他蛋白酶水解,不水解纤维蛋白和球蛋白。
Cas No.:9001-12-1
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
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- Biological Activity: >125CDU/mg
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本协议仅提供一个指导,请根据您的具体需要进行修改。
1. 溶液配制
(1)工作液:通常用HBSS平衡盐溶液(含Ca2+、Mg2+)制备成1-2mg/mL的工作液。0.22µm滤膜过滤除菌。组织和细胞分散推荐使用工作浓度为0.5-2.5mg/mL,软骨消化推荐使用工作浓度为1-2mg/mL。
注意:未使用的溶液请分装保存在-20°C避光冷冻,使用前在冰上解冻,避免反复冻融。
2. 使用Collagenase IA进行组织分离方案:
(1)用无菌手术刀或剪刀将组织切成3-4mm3大小的组织块。
(2)用含 Ca2+、Mg2+ 的HBSS洗涤组织块数次。
(3)加入足量的含 Ca2+、Mg2+ 的HBSS浸没组织块,并加入Collagenase IA至需要工作浓度。
(4)于 37°C 孵育4-18h。消化时使用水平摇床以及用3mM的CaCl2 补充消化可以提高消化效率。
(5)分散的细胞可以用网筛收集备用,未完全解离的组织可以用新鲜的Collagenase IA工作液在37℃进一步消化。
(6)用不含胶原酶的HBSS洗涤收集的细胞。
(7)用细胞培养基重悬上述细胞,接种到装有合适培养基的培养皿上。
3. 使用Collagenase IA获取原代软骨细胞方案[1](来自文献,仅供参考)
(1)取材:从小鼠的单个胸骨中分离组织置于冰上,用PBS冲洗3次以除去血液。将组织块在平皿中切成1mm3 小片。
(2)将组织放入0.1%的Collagenase IA溶液中进行初步消化。
(3)将初步消化后的组织转移到0.2%的Collagenase IA溶液中进行进一步消化。
(4)将消化后的细胞在DMEM/Ham’s F‐12(1:1)培养基中培养,该培养基中补充了10%的胎牛血清(FCS)。在细胞汇合达到80%时,进行后续实验。
(5)通过加入50µg/ml的抗坏血酸(GC12070)进行软骨细胞的分化诱导,并培养10天。
注意:以上实验方案为使用Collagenase IA进行组织分离提供指导。可以根据其他文献和具体实验要求进行调整。
References:
[1]Westermann L M, Baranowsky A, Di Lorenzo G, et al. Transgenic inhibition of interleukin-6 trans-signaling does not prevent skeletal pathologies in mucolipidosis type II mice[J]. Scientific Reports, 2021, 11(1): 3556.
Collagenase IA is a proteolytic enzyme commonly used to digest extracellular matrix proteins[1]. Collagenase IA specifically acts on procollagen, breaking it and then hydrolyzing it with other proteases, but does not hydrolyze fibrin and globulin. Collagenase can cleave the bond between neutral amino acids and glycine in the Pro-X-Glyc-Pro sequence, which is common in collagen[2]. Collagenase requires the activation of divalent cations such as Ca2+ and Zn2+ [3]. Collagenase activity is inhibited by ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), dithiothreitol (DTT), detergents, hexachlorocyclohexane, and heavy metal ions (Hg2+, Pb2+, Cd2+)[4]. Collagenase is relatively mild and has good dissociation ability under physiological temperature and physiological pH conditions, without the need for mechanical stirring or special equipment. This product is derived from Bacillus histolyticus, with an optimum pH of 7-8 and an enzyme activity ≥125CDU/mg solid (CDU = collagen digestion unit).
Activity definition: At pH 7.5, 25°C, in the presence of calcium ions, one unit of di-GPA hydrolysis will hydrolyze 1.0μM furanyl acryloyl-Leu-Gly-Pro-Ala per minute. One unit of neutral protease will hydrolyze casein to produce a color equivalent to 1.0μM tyrosine per 5h at pH 7.5 and 37°C. At pH 7.6, 25°C, in the presence of DTT, each unit of clostripain will hydrolyze 1.0μM BAEE per minute.
References:
[1] Sekhon B S. Matrix metalloproteinases–an overview[J]. Research and Reports in Biology, 2010: 1-20.
[2] Trabelsi O, Dumas V, Breysse E, et al. In vitro histomechanical effects of enzymatic degradation in carotid arteries during inflation tests with pulsatile loading[J]. Journal of the mechanical behavior of biomedical materials, 2020, 103: 103550.
[3] Eming S, Smola H, Hartmann B, et al. The inhibition of matrix metalloproteinase activity in chronic wounds by a polyacrylate superabsorber[J]. Biomaterials, 2008, 29(19): 2932-2940.
[4] Daboor S M, Budge S M, Ghaly A E, et al. Extraction and purification of collagenase enzymes: a critical review[J]. Am. J. Biochem. Biotechnol, 2010, 6(4): 239-263.
Collagenase IA是一种蛋白水解酶,常用于消化细胞外基质蛋白[1]。Collagenase IA专一作用于原胶原,使其断裂进而被其他蛋白酶水解,不水解纤维蛋白和球蛋白。胶原酶可以切割 Pro-X-Glyc-Pro序列中的中性氨基酸与甘氨酸之间的键,这些序列在胶原蛋白中很常见[2]。胶原酶需要借助二价阳离子如Ca2+、 Zn2+等活化酶的活性[3]。胶原酶的活性会受到乙二胺四乙酸(EDTA)、二硫苏糖醇(DTT)、洗涤剂、六氯环己烷和重金属离子(Hg2+、Pb2+、Cd2+)等的抑制作用[4]。胶原酶相对温和,在生理温度和生理pH值条件下具有良好的解离能力,无需机械搅拌或特殊设备。本产品来源于溶组织棱状芽胞杆菌,最适pH为7-8,酶活力≥125CDU/mg固体(CDU =胶原蛋白消化单位)。
活力定义:在pH 7.5、25 °C和钙离子存在下,一个双GPA水解单元每分钟水解1.0μM呋喃基丙烯酰基-Leu-Gly-Pro-Ala。一个中性蛋白酶单位水解酪蛋白,在pH 7.5和37℃下每5小时产生相当于1.0μM酪氨酸的颜色。在pH 7.6、25℃、DTT存在下,每单位梭菌蛋白酶每分钟水解1.0μM BAEE。
Cas No. | 9001-12-1 | SDF | |
别名 | 骨胶原酶; 胶原蛋白水解酶 | ||
分子式 | 分子量 | ||
溶解度 | 储存条件 | Store at -20°C | |
General tips | 请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液;一旦配成溶液,请分装保存,避免反复冻融造成的产品失效。 储备液的保存方式和期限:-80°C 储存时,请在 6 个月内使用,-20°C 储存时,请在 1 个月内使用。 为了提高溶解度,请将管子加热至37℃,然后在超声波浴中震荡一段时间。 |
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Shipping Condition | 评估样品解决方案:配备蓝冰进行发货。所有其他可用尺寸:配备RT,或根据请求配备蓝冰。 |
第一步:请输入基本实验信息(考虑到实验过程中的损耗,建议多配一只动物的药量) | ||||||||||
给药剂量 | mg/kg | 动物平均体重 | g | 每只动物给药体积 | ul | 动物数量 | 只 | |||
第二步:请输入动物体内配方组成(配方适用于不溶于水的药物;不同批次药物配方比例不同,请联系GLPBIO为您提供正确的澄清溶液配方) | ||||||||||
% DMSO % % Tween 80 % saline | ||||||||||
计算重置 |
计算结果:
工作液浓度: mg/ml;
DMSO母液配制方法: mg 药物溶于 μL DMSO溶液(母液浓度 mg/mL,
体内配方配制方法:取 μL DMSO母液,加入 μL PEG300,混匀澄清后加入μL Tween 80,混匀澄清后加入 μL saline,混匀澄清。
1. 首先保证母液是澄清的;
2.
一定要按照顺序依次将溶剂加入,进行下一步操作之前必须保证上一步操作得到的是澄清的溶液,可采用涡旋、超声或水浴加热等物理方法助溶。
3. 以上所有助溶剂都可在 GlpBio 网站选购。