Cytotoxicity LDH Assay Kit

一．对照设置

高对照：含细胞、培养基，每孔加10μL Lysis Solution；用于测定细胞的最大可释放LDH。
高对照空白：含培养基，每孔加10μL Lysis Solution；用于扣除高对照本底吸光度值。
低对照：含细胞、培养基，不做裂解处理；用于测定未经处理的正常细胞的自发LDH释放。
背景空白：含培养基；用于扣除低对照及样品孔本底吸光度值。

表1: 组别设置

二．使用方法

1.预实验(细胞数的最佳化)

1)用培养基洗涤细胞后，制成5×10⁵ cells/ml的细胞悬液。
2)向96孔板中每孔加入100μL培养基。
3)如图1所示，向96孔板中A行 (高对照和低对照各3个孔) 加入100μL细胞悬液后，用多通道移液器按1/2比例用培养基稀释成一个系列细胞梯度。

图1: 预实验96孔板细胞梯度配制例

另外，准备高对照空白(培养基+ Lysis Solution)和背景空白 (只有培养基) 各3个孔。
4)在37℃ CO₂培养箱中培养。
＊培养时间设定与细胞毒性实验在37℃ CO2培养箱内培养合适的时间一致。
5)在高对照孔和高对照空白孔中加入10μL Lysis Solution，在低对照孔和背景空白孔中加入10μL培养基。
6)在37℃ CO₂培养箱中培养30 min。
7)直接法：每孔吸掉50μL 培养基上清，以剩余培养基及细胞作为检测对象，向每孔中加入 50μL Working Solution，震荡混匀。
  间接法：从每孔中吸取50μL 上清液至新的96孔板中。而后在新的96孔板每孔中加入 50 μL Working Solution，震荡混匀。
＊为了避免吸出细胞，请小心吸取上清液。
＊直接法适用于不需要收集活细胞进行其它实验，间接法适用于需要收集活细胞进行其它实验。根据实验目的选择其中一种方法测定LDH活性。
8)采用包裹铝箔等方法避光，在室温孵育。
＊加入Working Solution后，吸光度与反应时间成正比，建议0-30 min内检测。
＊由于不同细胞差异较大，建议首次实验时，分别测定0 min，5 min，10 min，20 min，30 min时的吸光度，以便确定最佳反应时间。
9) 在每孔中加入50μL Stop Solution后，立刻用酶标仪测定490nm的吸光度。
＊以吸光度为X轴，细胞浓度为Y轴绘图，根据下面的要求选择最佳的细胞浓度：
-高对照和低对照的O.D.值之差>0.2;
-在线性曲线上的该细胞浓度的O.D.值<2.0。

2. 细胞毒性检测

1) 在96孔板中接种细胞悬液（100μL/孔），将培养板放在培养箱中预培养24h。
2) 向培养板加入不同浓度的待测药物。
3) 将培养板在培养箱孵育适当时间。
4) 在高对照孔和高对照空白孔中加入10μL Lysis Solution，在低对照孔中加入10μL培养基，37℃ CO₂培养箱内培养30 min。
5) 直接法：每孔吸掉50μL 培养基上清，以剩余培养基及细胞作为检测对象，向每孔中加入50μL Working Solution，震荡混匀。
    间接法：从每孔中吸取50μL 上清液至新的96孔板中。而后在新的96孔板每孔中加入 50μL Working Solution，震荡混匀。
＊直接法适用于不需要收集活细胞进行其它实验，间接法适用于需要收集活细胞进行其它实验。根据实验目的选择其中一种方法测定 LDH活性。
6) 室温避光孵育。
＊培养时间与预实验的一致。
7) 在每孔加入50μL Stop Solution 后，立即用酶标仪测定490nm处的吸光度。
＊配合使用 CCK-8 (GK10001)可获得死细胞和活细胞数据。

3.数据处理

Cytotoxicity(%)=[(X-Z)/(Y-Z)] ×100%
其中 X：样品孔吸光度值-背景空白孔吸光度值
       Y：高对照孔吸光度值-高对照空白孔吸光度值
       Z：低对照孔吸光度值-背景空白孔吸光度值

图2: 丝裂霉素C对L-929细胞的毒性

三．注意事项

1. 96 孔板的选择：直接法中贴壁细胞和悬浮细胞都使用平底 96 孔板；间接法中贴壁细胞使用平底 96 孔板，悬浮细胞使用圆底或 V 底 96 孔板。
2. 使用 96 孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。
一方面，由于 96 孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的 PBS、水或培养液；另一方面，可以把 96 孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。
3. 用酶标仪检测前需确保每孔内没有气泡，否则会干扰测定。
4. 建议采用多通道移液器，以减小平行孔间的差异。
5. 由于血清含有乳酸脱氢酶，建议血清的使用浓度不要超过 1%，并最好使用热灭活血清。如果一定需要使用10% 血清，在检测时一定要设置背景空白（仅含培养基），以用于消除背景。
6. 细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大等因素，都会造成细胞释放乳酸脱氢酶增加。