Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit

使用方法：

1.   裂解细胞：

将报告基因细胞裂解液充分混匀后，按如下方式加入报告基因细胞裂解液， 充分裂解细胞。

1.1)    对于贴壁细胞：吸尽细胞培养液后，参考下表加入适量的报告基因细胞裂解液；对于悬浮细胞：离心去上清后，参考下表加入适量报告基因细胞裂解液。

         注： 裂解产物可室温保存 6 h， -70℃可长期存放(裂解产物不能反复冻融);

         注 ：如果萤光素酶的表达水平比较低，可以尝试使用更少的裂解液，例如 6 孔板的每孔用量可以最小为100 微升。

1.2) 充分裂解后， 10,000-15,000g 离心 3-5 分钟，取上清用于测定。

         注：细胞裂解后可以立即测定萤光素酶，也可以先冻存，待以后再测定。冻存样品需融解，并达到室温后再进行测定。

2.   Preparation of Firefly Working Solution

2.1) 将所有组分恢复至室温。

2.2) 配置 10 mg/mL D-luciferin 储存液 。2mg 组份 C 溶解在 200uL 超纯水中。 储存液-20℃可以储存 6 个月反复冻融 5 次。

2.3) 工作液配置 ：用组分 B 按照 1:50 稀释以上 D-luciferin 储存液，配制成 0.2 mg/mL 的萤火虫萤光素酶工作液。

注： 萤火虫萤光素酶工作液不能反复冻融超过 5 次，若单次实验用量较少，建议按单次使用量分装成小规格。

3.   Preparation of Renilla Working Solution

3.1)  将所有组分恢复至室温。

3.2) 配置 2 mg/mL Coelenterazine 储存液 。400ug 组份 E 溶解在 200uL 乙醇中。 储存液-80℃可以储存 6 个月反复冻融 5 次。 

3.3) 工作液配置 ：用组分 D 按照 1:50 稀释以上 coelenterazine 储存液，配制成 0.04 mg/mL 的 1x coelenterazine 工作液。

注：1×Coelenterazine 工作液现配现用， 配置后在 3 小时内使用 。

4.   化学发光值检测

4.1） 按仪器操作说明书开启具有检测化学发光功能的仪器如酶标仪。

4.2） 每个样品测定时，取样品 20-100uL(如果样品量足够， 请加入 100 μ L；如果样品量不足可适当减少用量，但检测孔用量需保持一

致）。 1× Lysis Buffer 为空白对照。

4.3） 加入 100uL 萤火虫萤光素酶检测液，  用枪吹打均匀或用其它适当方式混匀后测定 RLU（relative light unit）值。 注：由于该发光为瞬时发光，建议加入萤火虫萤光素酶工作液后，立即进行检测。

4.4） 加入 100uL 1× Coelenterazine 工作液，用枪吹打均匀或用其它适当方式混匀后测定 RLU（relative light unit）值。

4.5） 在以海肾萤光素酶为内参的情况下，  用萤火虫萤光素酶测定得到的 RLU 值除以海肾萤光素酶测定得到的 RLU 值。根据得到的比值来比 较不同样品间目的报告基因的激活程度。如果以萤火虫萤光素酶为内参，也可以进行类似计算。

注意事项:

1)为取得最佳测定效果，在用单管的化学发光仪测定时，  样品和测定试剂混合后到测定前的时间应尽量控制一致；使用具有化学发光测定功 能的多功能荧光酶标仪时，宜先把样品全部加好，然后统一加入萤火虫萤光素酶检测试剂。

2) 由于温度对酶反应有影响，所以测定时，样品和试剂均需达到室温后再进行测定。

3 本公司所有产品仅限于专业人员用于生命科学研究，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅。

4) 本公司所有产品必须由合格专业技术人员操作同时佩戴口罩/手套/实验服并遵守生物实验室安全操作规程！