Fluo-3AM
(Synonyms: 钙荧光探针Fluo3-AM,Fluo-3-pentaacetoxymethyl ester) 目录号 : GC33437
Fluo-3AM是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。
Cas No.:121714-22-5
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
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Fluo-3AM is one of the most commonly used fluorescent probes to detect intracellular calcium ion concentration.After it penetrates the cell membrane and enters the cell, it is cleaved by the esterase in the cell to form Fluo-3, so as to be retained in the cell.Fluo-3 is almost non-fluorescent when it exists in the form of free ligand, but it can produce strong fluorescence when it combines with intracellular calcium ions, with a maximum excitation wavelength of 506nm and a maximum emission wavelength of 526nm. In actual detection, the recommended excitation wavelength is about 488nm and the emission wavelength is 525-530nm. Changes in intracellular calcium concentration can be detected using laser confocal microscopy or flow cytometry[1-4].
References:
[1]. Loughrey CM, MacEachern KE, et,al. Measurement of the dissociation constant of Fluo-3 for Ca2+ in isolated rabbit cardiomyocytes using Ca2+ wave characteristics. Cell Calcium. 2003 Jul;34(1):1-9. doi: 10.1016/s0143-4160(03)00012-5. PMID: 12767887.
[2]. Ji S, Li S, Zhao X, et,al.Protective role of phenylethanoid glycosides, Torenoside B and Savatiside A, in Alzheimer's disease. Exp Ther Med. 2019 May;17(5):3755-3767. doi: 10.3892/etm.2019.7355. Epub 2019 Mar 7. PMID: 30988761; PMCID: PMC6447766.
[3]. Williams PDE, Verma S, et,al.Adapting techniques for calcium imaging in muscles of adult Brugia malayi. Invert Neurosci. 2020 Aug 16;20(3):12. doi: 10.1007/s10158-020-00247-1. PMID: 32803437; PMCID: PMC7891862.
[4]. Williams PDE, Kashyap SS, et,al.Diethylcarbamazine, TRP channels and Ca2+ signaling in cells of the Ascaris intestine. Sci Rep. 2022 Dec 9;12(1):21317. doi: 10.1038/s41598-022-25648-7. PMID: 36494409; PMCID: PMC9734116.
Fluo-3AM是最常用的检测细胞内钙离子浓度的荧光探针之一。它穿透细胞膜进入细胞后被细胞内的酯酶剪切形成 Fluo-3 ,从而被滞留在细胞内。 Fluo-3 若以游离配体形式存在时几乎是非荧光性的,但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光,最大激发波长为 506nm,最大发射波长为 526nm 实际检测时推荐使用的激发波长为 488nm 左右,发射波长为 525~530nm。 可以使用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度的变化[1-4]。
本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。
1.制备染色液
(1)配置储存液: 在高质量无水DMSO中制备浓度为1-10mM的AM酯储存液；
注意:
① 未使用的储存液分装后在-20℃或-80°C避光保存，避免反复冻融；
② 乙酰氧基甲基酯(AM)易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。
(2)配置工作液:用合适的缓冲液(如:无血清和酚红的培养基或PBS)稀释储存液，配制浓度为1-10μM的工作液。
注意:
① AM酯染色工作液制备时，有时需要往储存液中加入适量的20% Pluronic F-127溶液，以增强AM探针的水溶性；
② Pluronic F-127可以防止AM探针在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但PluronicF-127可降低AM探针的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存；
③ 配制20%(w/v) Pluronic F-127母液:称取100mg Pluronic F-127粉末(货号: GB30090)，加入500μl DMSO，40-50℃加热20-30min，室温保存。如有结晶析出可重新加热溶解，不影响使用；
④ （可选）GLPBIO提供溶解好的Pluronic F-127(20% Solution in DMSO) ，货号：GB30091；
⑤ 添加等体积20% Pluronic F-127溶液到储存液中，从而使Pluronic F-127的最终工作浓度约为0.02%；
⑥ 请根据实际情况调整工作液浓度，现用现配，避免反复冻融。
2.细胞悬浮染色
(1)悬浮细胞：经4°C、1000g离心3-5分钟，弃去上清液，使用PBS或其他缓冲液清洗两次，每次5分钟；
(2)贴壁细胞：使用PBS或其他缓冲液清洗两次，加入胰酶消化细胞，消化完成后经1000g离心3-5min；
(3)加入染料工作溶液重悬细胞，室温或低于室温条件下避光孵育20min-2h。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索；
注：
① AM酯类染料在大部分细胞中的推荐工作浓度为4-5μM，具体使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度；
② （可选）如果细胞内含有机阴离子转运体，可能需要在细胞培养基中加入丙磺舒(GC16825，Probenecid，1-2.5mM)或磺吡酮(GC11049 ，Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM)，以降低去酯化 探针的泄露水平。丙磺舒或磺吡酮储存液偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH；
③ 若使用含血清的培养基，血清内酯酶会降解AM，从而降低染料加载效果；而含酚红培养基会使本底值略偏高，建议加入染色工作液前，对细胞清洗2~3次；
④ 降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。
(4)孵育结束后，经1000g离心5分钟，去除染色液，加入PBS或其他缓冲液清洗2-3次，去除残留探针；
(5)室温再孵育30min以保证细胞内AM的完全去酯化。
3.细胞贴壁染色
(1)在无菌盖玻片上培养贴壁细胞；
(2)从培养基中移走盖玻片，吸出过量的培养基，将盖玻片放在潮湿的环境中；
(3)从盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞；
(4) 室温或低于室温条件下避光孵育20min-2h。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索；
(5)孵育结束后吸弃染料工作液，使用PBS或其他缓冲液清洗盖玻片2~3次；
(6)室温孵育30min。
4.显微镜检测：Fluo-3AM的最大激发/发射波长为488/526nm。
注意事项：
1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
| Cas No. | 121714-22-5 | SDF | |
| 别名 | 钙荧光探针Fluo3-AM,Fluo-3-pentaacetoxymethyl ester | ||
| Canonical SMILES | ClC(C=C1C(C2=CC(OCCOC(C=C(C)C=C3)=C3N(CC(OCOC(C)=O)=O)CC(OCOC(C)=O)=O)=C(N(CC(OCOC(C)=O)=O)CC(OCOC(C)=O)=O)C=C2)=C(C=C4Cl)C5=CC4=O)=C(C=C1O5)OCOC(C)=O | ||
| 分子式 | C51H50Cl2N2O23 | 分子量 | 1129.85 |
| 溶解度 | Acetonitrile: 2 mg/ml,DMSO: 0.9 mg/ml | 储存条件 | Store at -20°C,protect from light |
| General tips | 请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。 储备液的保存方式和期限：-80°C 储存时，请在 6 个月内使用，-20°C 储存时，请在 1 个月内使用。 为了提高溶解度，请将管子加热至37℃，然后在超声波浴中震荡一段时间。 |
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| Shipping Condition | 评估样品解决方案：配备蓝冰进行发货。所有其他可用尺寸：配备RT，或根据请求配备蓝冰。 | ||
| 制备储备液 | |||
 |
1 mg | 5 mg | 10 mg |
| 1 mM | 0.8851 mL | 4.4254 mL | 8.8507 mL |
| 5 mM | 0.177 mL | 0.8851 mL | 1.7701 mL |
| 10 mM | 0.0885 mL | 0.4425 mL | 0.8851 mL |
| 第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量） | ||||||||||
| 给药剂量 | mg/kg |  |
动物平均体重 | g | |
每只动物给药体积 | ul | |
动物数量 | 只 |
| 第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶于水的药物；不同批次药物配方比例不同，请联系GLPBIO为您提供正确的澄清溶液配方） | ||||||||||
| % DMSO % % Tween 80 % saline | ||||||||||
| 计算重置 | ||||||||||
计算结果:
工作液浓度： mg/ml；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL，
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL saline，混匀澄清。
1. 首先保证母液是澄清的；
2.
一定要按照顺序依次将溶剂加入，进行下一步操作之前必须保证上一步操作得到的是澄清的溶液，可采用涡旋、超声或水浴加热等物理方法助溶。
3. 以上所有助溶剂都可在 GlpBio 网站选购。
Quality Control & SDS
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