Fura-2 AM
(Synonyms: 荧光钙探针Fura2-AM,Fura-2 Acetoxymethyl ester) 目录号 : GC16578A membrane-permeable, UV-light excitable form of Fura-2
Cas No.:108964-32-5
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
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Fura-2 AM is a ratiometric fluorescent Ca2+ indicator.
The trypsin (100 nM) mediated Ca2+ transients are imagined in tsA-201 cells loaded with either 750 nM (n=111), 500 nM (n=119) or 250 nM (n=130) Fura-2 AM and compare the average Ca2+ increase above the baseline to the value obtained in the initial experiments using 1 μM of Fura-2 AM. The Ca2+ increases above the baseline for the 750, 500 and 250 nM are 633.0±33.9 nM (n=111, P>0.05 compare to 1 μM Fura-2 AM), 552.6±22.7 nM (n=119, P>0.05 compare to 1 μM Fura-2 AM) and 616.0±24.9 nM (n=130, P>0.05 compare to 1 μM Fura-2 AM), respectively[1].
References:
[1]. Tinning PW, et al. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. J Microsc. 2017 Aug 24.
[2]. Odmara L Barreto-Chang, et al. Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 2009 Jan 19;(23). pii: 1067.
本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。
1.制备染色液
(1)配置储存液: 在高质量无水DMSO中制备浓度为1-10mM的AM酯储存液；
注意:
① 未使用的储存液分装后在-20℃或-80°C避光保存，避免反复冻融；
② 乙酰氧基甲基酯(AM)易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。
(2)配置工作液:用合适的缓冲液(如:无血清和酚红的培养基或PBS)稀释储存液，配制浓度为1-10μM的工作液。
注意:
① AM酯染色工作液制备时，有时需要往储存液中加入适量的20% Pluronic F-127溶液，以增强AM探针的水溶性；
② Pluronic F-127可以防止AM探针在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但PluronicF-127可降低AM探针的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存；
③ 配制20%(w/v) Pluronic F-127母液:称取100mg Pluronic F-127粉末(货号: GB30090)，加入500μl DMSO，40-50℃加热20-30min，室温保存。如有结晶析出可重新加热溶解，不影响使用；
④ （可选）GLPBIO提供溶解好的Pluronic F-127(20% Solution in DMSO) ，货号：GB30091；
⑤ 添加等体积20% Pluronic F-127溶液到储存液中，从而使Pluronic F-127的最终工作浓度约为0.02%；
⑥ 请根据实际情况调整工作液浓度，现用现配，避免反复冻融。
2.细胞悬浮染色
(1)悬浮细胞：经4°C、1000g离心3-5分钟，弃去上清液，使用PBS或其他缓冲液清洗两次，每次5分钟；
(2)贴壁细胞：使用PBS或其他缓冲液清洗两次，加入胰酶消化细胞，消化完成后经1000g离心3-5min；
(3)加入染料工作溶液重悬细胞，室温或低于室温条件下避光孵育20min-2h。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索；
注：
① AM酯类染料在大部分细胞中的推荐工作浓度为4-5μM，具体使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度；
② （可选）如果细胞内含有机阴离子转运体，可能需要在细胞培养基中加入丙磺舒(GC16825，Probenecid，1-2.5mM)或磺吡酮(GC11049 ，Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM)，以降低去酯化 探针的泄露水平。丙磺舒或磺吡酮储存液偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH；
③ 若使用含血清的培养基，血清内酯酶会降解AM，从而降低染料加载效果；而含酚红培养基会使本底值略偏高，建议加入染色工作液前，对细胞清洗2~3次；
④ 降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象。
(4)孵育结束后，经1000g离心5分钟，去除染色液，加入PBS或其他缓冲液清洗2-3次，去除残留探针；
(5)室温再孵育30min以保证细胞内AM的完全去酯化。
3.细胞贴壁染色
(1)在无菌盖玻片上培养贴壁细胞；
(2)从培养基中移走盖玻片，吸出过量的培养基，将盖玻片放在潮湿的环境中；
(3)从盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞；
(4) 室温或低于室温条件下避光孵育20min-2h。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索；
(5)孵育结束后吸弃染料工作液，使用PBS或其他缓冲液清洗盖玻片2~3次；
(6)室温孵育30min。
4.显微镜检测：Fura-2 AM的最大激发/发射波长为336/515nm。
注意事项：
1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
References:
[1]. Odmara L Barreto-Chang,Ricardo E Dolmetsch. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. 2009 Jan 19:(23):1067. doi: 10.3791/1067.
[2]. Magdiel Martínez, Namyr A Martínez, Walter I Silva. Measurement of the Intracellular Calcium Concentration with Fura-2 AM Using a Fluorescence Plate Reader. 2017 Jul 20;7(14):e2411. doi: 10.21769/BioProtoc.2411.
| Cas No. | 108964-32-5 | SDF | |
| 别名 | 荧光钙探针Fura2-AM,Fura-2 Acetoxymethyl ester | ||
| 化学名 | bis(acetoxymethyl) 2,2'-((2-(5-((acetoxymethoxy)carbonyl)oxazol-2-yl)-4-(2-(2-(bis(2-(acetoxymethoxy)-2-oxoethyl)amino)-5-methylphenoxy)ethoxy)benzofuran-5-yl)azanediyl)diacetate | ||
| Canonical SMILES | O=C(CN(CC(OCOC(C)=O)=O)C1=CC=C2OC(C3=NC=C(C(OCOC(C)=O)=O)O3)=CC2=C1OCCOC4=CC(C)=CC=C4N(CC(OCOC(C)=O)=O)CC(OCOC(C)=O)=O)OCOC(C)=O | ||
| 分子式 | C44H47N3O24 | 分子量 | 1001.85 |
| 溶解度 | DMSO: 10 mg/ml | 储存条件 | Store at -20°C,protect from light,unstable in solution, ready to use. |
| General tips | 请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。 储备液的保存方式和期限：-80°C 储存时，请在 6 个月内使用，-20°C 储存时，请在 1 个月内使用。 为了提高溶解度，请将管子加热至37℃，然后在超声波浴中震荡一段时间。 |
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| Shipping Condition | 评估样品解决方案：配备蓝冰进行发货。所有其他可用尺寸：配备RT，或根据请求配备蓝冰。 | ||
| 制备储备液 | |||
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1 mg | 5 mg | 10 mg |
| 1 mM | 0.9982 mL | 4.9908 mL | 9.9815 mL |
| 5 mM | 0.1996 mL | 0.9982 mL | 1.9963 mL |
| 10 mM | 0.0998 mL | 0.4991 mL | 0.9982 mL |
| 第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量） | ||||||||||
| 给药剂量 | mg/kg |  |
动物平均体重 | g | |
每只动物给药体积 | ul | |
动物数量 | 只 |
| 第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶于水的药物；不同批次药物配方比例不同，请联系GLPBIO为您提供正确的澄清溶液配方） | ||||||||||
| % DMSO % % Tween 80 % saline | ||||||||||
| 计算重置 | ||||||||||
计算结果:
工作液浓度： mg/ml；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL，
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL saline，混匀澄清。
1. 首先保证母液是澄清的；
2.
一定要按照顺序依次将溶剂加入，进行下一步操作之前必须保证上一步操作得到的是澄清的溶液，可采用涡旋、超声或水浴加热等物理方法助溶。
3. 以上所有助溶剂都可在 GlpBio 网站选购。
Quality Control & SDS
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