HADA
(Synonyms: HCC-Amino-D-alanine hydrochloride) 目录号 : GC50533
HADA（HCC-氨基-D-丙氨酸盐酸盐）是一种蓝色荧光D-氨基酸（FDAA），适用于标记活细菌中的肽聚糖，激发/发射λ ~405/460 nm。
Cas No.:2253733-10-5
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
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Quality Control & SDS
- View current batch:
- Purity: >98.00%
- COA (Certificate Of Analysis)
- SDS (Safety Data Sheet)
- Datasheet
本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。
1. 提前准备以下溶液：TSB（或LB）、TSB（LB）琼脂平板、50 mM HADA原液（溶于DMAO）、10×和1×柠檬酸钠缓冲液、1×PBS和3%多聚甲醛。
2. 在冰上解冻细菌菌株的甘油原液。使用接种环将菌株划线接种在TSB琼脂平板上，并在 37 °C下孵育过夜。之后用单个细菌菌落接种25 ml TSB（或LB）培养基，并在37 °C下孵育过夜。
3. 将过夜培养物在TSB（或LB）培养基中稀释至OD578为0.1，并在37 °C下生长，直到其达到指数OD578为0.4。
4. 使用37°C预热的TSB（或LB）将细菌稀释至OD578为0.1，取500 μl置于无菌1.5 ml微管中。
5. 将2.5 µl 50 mM HADA储备液加入到样品中，使最终浓度达到 250 μM，并在37 °C下振荡孵育30分钟。
6. 将最终体积十分之一的提前预冷的10×柠檬酸钠缓冲液（50 µl，pH 2.25）加入到正在生长的培养物中。
7. 在4 °C下以16,200 xg的速度将样品离心2分钟。吸弃上清，使用1.5 ml冰冷的1×柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0）重悬沉淀。
8. 在4 °C下以16,200 xg的速度将样品离心2分钟。吸弃上清，使用1.5 ml冰冷的1×PBS（pH 7.4）重悬沉淀，然后再次离心样品。用冰冷的 1×PBS（pH 7.4）重复清洗步骤一次。小心地吸弃上清，不要接触细菌沉淀。
9. 将细菌沉淀物悬浮于12.5 µl 1×PBS和12.5μl 3%多聚甲醛中，进行细菌固定。用移液器充分混合，并储存在冰上或4 °C条件下，直至进行显微镜分析。
10.显微镜分析：将3 μl固定细菌移入准备好的显微镜琼脂糖载玻片的孔中，小心地将方形盖玻片放在上面，轻轻按压。使用配备Cool SNAP HQ2CCD 相机的Eclipse Ti显微镜（Plan Fluor×100/1.30 Oil Ph3 DLL物镜）分析标记细菌，使用相差和DAPI通道（激发波长为 350/50 nm，发射波长为460/50 nm）。100 ms的曝光时间进行相差分析，1 s的曝光时间进行荧光图像分析。
注意事项：
1. 使用前需使用0.22 μm滤膜过滤并冰上预冷10×和1×柠檬酸钠缓冲液、1×PBS和3%多聚甲醛溶液。
2. HADA在酸性pH值或无缓冲水中几乎不发出荧光，在pH值高于7.0 时成像的细菌显示出 HADA 标记的最大亮度。最后两个清洗步骤至关重要。
3. 固定后应立即对标记细菌进行显微镜分析。
4. 此方案，所有分析的细菌都完全标记，在收缩细菌的隔膜处显示出更强的信号。向生长细菌中添加10×柠檬酸钠缓冲液，用pH值3.0的1×柠檬酸钠缓冲液进行初步清洗，并在冰上快速处理样品，可以改善未掺入的HADA的去除，并导致背景荧光信号降低和信号检测改善。
参考文献：
[1] Peters K, Pazos M, VanNieuwenhze M S, et al. Optimized Protocol for the Incorporation of FDAA (HADA Labeling) for in situ Labeling of Peptidoglycan[J]. Bio-protocol, 2019, 9(15): e3316-e3316.
HADA (HCC-amino-D-alanine hydrochloride) is a blue fluorescent D-amino acid (FDAA), which is suitable for peptides in living bacteria, which stimulates/emitted λ ~ 405/460 nm. Without affecting the growth rate, FDAA can effectively conduct an external peripheral and diaphragm marking of different bacterial cell groups to display mitochondrial permeability[1-2].
The D-FDAA probe can marked PG growth sites in a series of different bacteria. FDAA is mixed with PG through DD transpeptidase (penicillin binding protein, PBP) or LD transpeptidase (LDT) (if existence). FDAA can be marked with species in a fast growth process in only 30 seconds, such as E. coli. HADA is capable of reproducible, stable labeling of PG for most bacterial species, usually without extensive optimization[1-3].
References:
[1] Botella H, Yang G, Ouerfelli O, et al. Distinct spatiotemporal dynamics of peptidoglycan synthesis between Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis[J]. MBio, 2017, 8(5): 10.1128/mbio. 01183-17.
[2] Peters K, Pazos M, Edoo Z, Hugonnet JE, Martorana AM, Polissi A, VanNieuwenhze MS, Arthur M, Vollmer W. Copper inhibits peptidoglycan LD-transpeptidases suppressing β-lactam resistance due to bypass of penicillin-binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Oct 16;115(42):10786-10791.
[3] Mendes S S, Marques J, Mesterházy E, et al. Synergetic antimicrobial activity and mechanism of clotrimazole-linked CO-releasing molecules[J]. ACS bio & med Chem Au, 2022, 2(4): 419-436.
HADA（HCC-氨基-D-丙氨酸盐酸盐）是一种蓝色荧光D-氨基酸（FDAA），适用于标记活细菌中的肽聚糖，激发/发射λ ~405/460 nm。在不影响生长速率的情况下，FDAA能够对不同细菌细胞群进行有效的外周和隔膜标记，显示线粒体外膜通透性[1-2]。
D-氨基酸（FDAA）探针可以在一系列不同的细菌中标记 PG 生长位点。FDAA通过DD转肽酶（青霉素结合蛋白，PBP）或LD转肽酶（LDT）（如果存在）掺入PG 中。FDAA只需30秒即可标记处于快速生长过程的物种，如大肠杆菌。HADA 能够可复制的，稳定的标记大多数细菌物种的PG，通常无需大量优化[1-3]。
| Cas No. | 2253733-10-5 | SDF | |
| 别名 | HCC-Amino-D-alanine hydrochloride | ||
| Canonical SMILES | N[C@@H](C(O)=O)CNC(C1=CC(C=CC(O)=C2)=C2OC1=O)=O.Cl | ||
| 分子式 | C13H12N2O6.HCl | 分子量 | 328.71 |
| 溶解度 | DMSO : 125 mg/mL (380.27 mM; Need ultrasonic) | 储存条件 | Store at -20°C |
| General tips | 请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。 储备液的保存方式和期限：-80°C 储存时，请在 6 个月内使用，-20°C 储存时，请在 1 个月内使用。 为了提高溶解度，请将管子加热至37℃，然后在超声波浴中震荡一段时间。 |
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| Shipping Condition | 评估样品解决方案：配备蓝冰进行发货。所有其他可用尺寸：配备RT，或根据请求配备蓝冰。 | ||
| 制备储备液 | |||
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1 mg | 5 mg | 10 mg |
| 1 mM | 3.0422 mL | 15.211 mL | 30.422 mL |
| 5 mM | 0.6084 mL | 3.0422 mL | 6.0844 mL |
| 10 mM | 0.3042 mL | 1.5211 mL | 3.0422 mL |
| 第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量） | ||||||||||
| 给药剂量 | mg/kg |  |
动物平均体重 | g | |
每只动物给药体积 | ul | |
动物数量 | 只 |
| 第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶于水的药物；不同批次药物配方比例不同，请联系GLPBIO为您提供正确的澄清溶液配方） | ||||||||||
| % DMSO % % Tween 80 % saline | ||||||||||
| 计算重置 | ||||||||||
计算结果:
工作液浓度： mg/ml；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL，
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL saline，混匀澄清。
1. 首先保证母液是澄清的；
2.
一定要按照顺序依次将溶剂加入，进行下一步操作之前必须保证上一步操作得到的是澄清的溶液，可采用涡旋、超声或水浴加热等物理方法助溶。
3. 以上所有助溶剂都可在 GlpBio 网站选购。