MPEG-2000-DSPE

本程序仅提供指南，请根据您的具体需求进行修改。

制备tarin（一种植物凝集素）脂质体纳米胶囊^[1]

1.使用分析天平称量脂质体成分。

2.使用适合旋转蒸发器的250 mL容量瓶将脂质成分溶解在氯仿中，以避免材料损失。

3.以150 rpm的速度搅拌混合物15分钟。

4.在以下条件下使用旋转蒸发器去除氯仿：

1. 将容量瓶口调整到标准位置（25°）以获得最佳效率，同时与加热浴中的水接触。

NOTE: 设备臂应倾斜25°，以保持容量瓶和水浴之间的接触，同时不影响蒸发效率或损坏样品。标准位置可能因设备品牌而异。

1. 将冷凝器温度设置为最低3 °C。
2. 将加热浴温度设置为40±1 °C。
3. 将旋转设置为120 rpm。
4. 将真空调节至207 mbar，将沸点调节至20 °C。
5. 约25分钟后，取出烧瓶并适当丢弃冷凝器中剩余的蒸发溶剂。

注意：在此步骤中形成由脂质体成分组成的薄而不透明的薄膜，可以很容易地看到。冷凝器中剩余的蒸发溶剂必须存放在处置容器（氯化）中，由专业公司处理以进行适当丢弃。

5. 在含有1 mg/mL tarin 的0.3 M硫酸铵溶液（pH = 7.4）中将脂质膜水合至脂质浓度达到0.01 M，最终体积为10 mL。

1. 将混合物搅拌40分钟，并在4 °C下孵育过夜。

注意：此步骤可视为停止点。过夜孵育不是强制性的。

6. 孵育后，在25 °C（室温；RT）下对悬浮液进行超声处理1分钟，以减小囊泡尺寸并避免聚集。

注意：在以下条件下在超声波发生器中进行尺寸减小：130 W 和40 kHz。

7. 通过0.2 µm 聚碳酸酯孔膜进行12次循环挤压。

注意：在挤压过程之前，用水测试微型挤出机组件以避免样品泄漏。0.1 µm 孔膜也适用。在这种情况下，将微型挤出机支架预热至脂质转变温度以上以促进挤出，同时保持脂质和蛋白质的物理化学特性。

1. 按照制造商手册中的说明安装微型挤出机的零件。

2. 将聚碳酸酯膜放在两个预湿的过滤器支架之间，并将其放入支架中。

3. 将1 mL 空注射器插入设备，用脂质体悬浮液将另一个注射器填充至其总体积，然后将其插入另一侧。

4. 通过0.2 µm 聚碳酸酯孔膜进行12个循环挤出。将样品从一个注射器缓慢推入另一个注射器。将挤出的悬浮液收集在预冷的管中。

注意：仅当样品从一个注射器转移到另一个注射器变得困难时才应更换聚碳酸酯膜。由于 SUV 的形成导致尺寸减小，脂质体悬浮液在挤出过程中应变得清澈。在此步骤中，可能会损失约0.2 mL 的样品。

8. 通过超速离心分离脂质体。

注意：将样品保持在冰浴中，直到超速离心机准备就绪。使用带有摆动式转子的超速离心机，通过超速离心将 SUV 与剩余成分和硫酸铵分离。

1. 称量适合转子的钛管中的样品并平衡管子。根据所用转子检查所需的最小体积，以避免损坏管子，并在必要时用硫酸铵调整脂质体悬浮液体积。

注意：摆动式转子应始终支撑在支架上，以避免刮伤“斑马条纹”（即底部的黑白条纹），离心机使用这些条纹来确定转速。

2. 使用离心机前打开真空，使其冷却。

3. 将钛管安装到旋转桶中。

注意：将管子提升到运行时所处的位置，以确保它们完全贴合。

4. 释放真空，打开离心机门，将转子放入其中。

注意：注意转子底部的圆圈标记，该标记必须与离心机本身的圆圈标记方向相反。

5. 关闭离心机门，按下真空按钮，等待真空度从200降至 <20μm或从26 Pa 降至 <3 Pa。

6. 将超速离心机显示屏中的参数调整为150,000 x g（相当于上述旋转桶的29,600 rpm），在4 °C 下持续90分钟（加速度：最大，减速度：最大）。

注意：如果特定离心机以 rpm 为单位，则务必将速度转换为 x g。使用离心机网站根据所用转子转换单位。

7. 按 Recall，检查条件，然后按 Start 运行。

注意：等到离心机达到所需速度。

8. 90分钟后，按下真空按钮释放真空，当真空达到200-700 μm（相当于26-93 Pa）时打开离心机门。

9. 关闭离心机，从内部取出转子，将其与桶一起放在工作台上晾干。

10. 将超速离心的样品放在冰上。

9. 小心地将管倒置放入一次性15 mL 离心管中，将上清液与沉淀物分离，以分离上清液和沉淀物。

注意：将含有未封装蛋白质的上清液储存在4°C 下。它将用于确定包封效率。颗粒呈半透明胶状。

10. 将含有包封蛋白质的颗粒悬浮在 HEPES 缓冲盐水中（3 mL 1x HBS）。

注意：HBS 2x（原液）是通过在蒸馏水中稀释以下量的试剂来制备的：140 mM NaCl、1.5 mM Na₂HPO₄、50 mM HEPES，然后将 pH 值调节至7.4并将最终体积调节至100 mL。如果要确定脂质体浓度，可以用 NaHCO₃代替 Na₂HPO₄或省略以避免干扰。使用前，应将 HBS 2x 原液稀释在蒸馏水中以获得 HBS 1x。

References:

[1] Papachristos A, Pippa N, Ioannidis K, Sivolapenko G, Demetzos C. Liposomal forms of anticancer agents beyond anthracyclines: present and future perspectives. Journal of liposome research. 2015 Apr 3;25(2):166-73.