One-step TUNEL Apoptosis Detection Kit (Orange, CY3)

Ⅰ 需自备试剂：

       1. 细胞样本和冰冻切片：

       新鲜制备的4%多聚甲醛（PBS配置），0.2% Triton X-100（PBS配置）。悬浮细胞额外需要：20mM EDTA，0.1% Triton X-100（含 5mg/mL BSA，PBS配置）。

      可提前1-2天配置并4℃储存。

       2. 石蜡切片：

       二甲苯、无水乙醇。

       3. 其他试剂：

       PBS, ddH₂O, Antifade Mounting Medium with DAPI (Cat.No. GC26283)

Ⅱ 实验流程

1. 细胞爬片样本

1.1. 样本预处理

1.1.1. 在所需合适大小的孔板中，在 TC 处理的细胞爬片上培养贴壁细胞。在凋亡诱导处理之后，用 PBS漂洗爬片2次。

1.1.2.  加入过量的4%多聚甲醛，完全浸没爬片，在4°C放置25min，进行细胞固定。

1.1.3.用 PBS 溶液中清洗2-3次，每次室温放置5min。

1.1.4. 加入过量的0.2% Triton X-100，室温通透5min。

注意:优先推荐使用 Triton X-100进行通透。也可使用 Proteinase K 进行通透按1:100 的比例，用PBS 稀释浓度为2mg/mL的Proteinase K溶液，使其终浓度为20μg/mL。在每个样本上滴加100μL稀释好的Proteinase K溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育5min（孵育时间需摸索）。通透时间最长不要超过15 min。

1.1.5. 用 PBS 溶液中清洗2-3次，每次室温放置5min。

1.2.（可选步骤）阳性对照

1.2.1. 准备湿盒，底部倒入一层水，平展的铺上一层洁净的保鲜膜。

1.2.2. 按1:10的比例用ddH₂O将10×DNase I Buffer稀释成1×DNase I Buffer备用。

1.2.3. 滴加100μL 1×DNase I Buffer至湿盒内的保鲜膜上，将细胞爬片从孔板中取出，细胞面向下盖住1×DNase I Buffer，室温平衡5min。

1.2.4. 用1×DNase I Buffer稀释DNase I(2000U/mL)，使其终浓度为20U/mL。

1.2.5. 将50μL 20U/mL DNase I滴加至湿盒内的保鲜膜上。

1.2.6. 将细胞爬片取出，轻轻吸干多余水分，细胞面向下盖住20U/mL DNase I，37℃孵育10min。

1.2.7. 将细胞爬片取出，有细胞的一面向上放入洁净的孔板中，用过量PBS清洗3次，每次5min。

注意:阳性对照必须使用单独的染色缸或孔板。阳性对照上残余的DNaseI可能会在实验组中造成假阳性的错误信号。

1.3. 标记及检测

1.3.1. 准备避光湿盒，底部倒入一层水，平展的铺上一层洁净的保鲜膜。

1.3.2. 按1:5 的比例用ddH₂O将5×Equilibration Buffer稀释成1×Equilibration Buffer。

1.3.3. 滴加100μL 1×Equilibration Buffer至湿盒内的保鲜膜上，将细胞爬片从孔板中取出，细胞面向下盖住1×Equilibration Buffer，室温平衡5-10min。

1.3.4. 平衡期间，在冰浴和避光条件下按照下表配置标记液。

1.3.5.平衡结束后，将标记液50μL滴到洁净的保鲜膜上，取出爬片，用吸水纸吸干多余液体，盖住相应的标记液，注意避光。

注意:标记液体积:对于面积小于5cm²的反应，所需体积是50μL，用50μL乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需 TdT 标记反应液的总体积。对于表面积更大的样本，可成比例地增加试剂体积。

1.3.6盖紧湿盒的盖子，注意避光，防止爬片干燥，37℃孵育60min。

1.3.7取出爬片，轻轻去掉多余液体，放入新的孔板中，用新鲜的PBS 溶液清洗2 次，每次5min。

注意:如果背景过高，为了降低背景，样本在用PBS清洗后，可再用含0.1% Triton X-100 和5mg/mL BSA 的PBS 洗3次，每次 5min，这样可将游离的未反应标记物清除干净。

1.3.8载玻片上滴加1滴Antifade Mounting Medium with DAPI (Cat.No. GC26283)

1.3.9取出爬片，用吸水纸轻轻吸掉周围的溶液，盖住载玻片的Antifade Mounting Medium with DAPI，并进行封片。

1.3.10立即在荧光显微镜下分析样本，在激发/发射波长 550/570nm下观察橙红色荧光;或在激发/发射波长 356/451nm下观察 DAPI的蓝色荧光。

 2. 细胞涂片样本

2.1. 样本预处理

2.1.1. 细胞涂片:以2×10⁶cells/mL的浓度将细胞重悬于 PBS。吸取50-100μL细胞悬液涂片在多聚赖氨酸包被的载玻片上，晾干。进入后续实验。

2.1.2.  将涂片浸入装有4%多聚甲醛的染色缸中，在4℃放置25min进行细胞固定。

2.1.3.用 PBS 溶液清洗2-3次，每次室温放置5min。

2.1.4. 将涂片浸没于0.2% Triton X-100溶液中，室温通透5min。

注意:优先推荐使用 Triton X-100进行通透。也可使用 Proteinase K 进行通透，按1:100 的比例，用PBS 稀释浓度为2mg/mL的Proteinase K溶液，使其终浓度为20μg/mL。在每个样本上滴加100μL 稀释好的Proteinase K溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育5min（孵育时间需摸索）。

2.1.5. 用PBS溶液清洗2-3次，每次室温放置5min。

2.1.6. 轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理好的样本放在湿盒中保持湿润。

2.2. （可选步骤）阳性对照

2.2.1. 准备避光湿盒，底部放入用水浸湿的纸巾，载玻片全部转移到湿盒中。

2.2.2. 按1:10的比例用ddH₂O将10×DNase I Buffer稀释成1×DNase I Buffer备用。

2.2.3. 滴加 100μL 1×DNase I Buffer 至已通透的样本上，室温平衡5min。

2.2.4. 用 1×DNase I Buffer 稀释 DNase I(2000U/mL)，使其终浓度为20U/mL。

2.2.5. 轻轻吸干载玻片上的多余液体，每个阳性对照样品滴加100μL 20U/mL DNase I溶液。

2.2.6.  37℃孵育10min。

2.2.7. 轻轻吸干载玻片上的多余液体，用PBS清洗3次，每次5min。

注意:阳性对照载玻片必须使用单独的染色缸。阳性对照载玻片上残余的DNase I可能会在实验组中造成假阳性的错误信号。

2.3. 标记及检测

2.3.1. 底部放入用水浸湿的纸巾，载玻片全部转移到湿盒中。

2.3.2. 按 1:5 的比例用 ddH₂O 将5×Equilibration Buffer 稀释成1×Equilibration Buffer。

2.3.3. 滴加 100μL 1×Equilibration Buffer 至湿盒内的样品上，室温平衡 5-10min。

2.3.4. 平衡期间，在冰浴和避光条件下按照下表配置标记液。

2.3.5.平衡结束后，用吸水纸吸干多余液体，在样本上滴加50μL标记液，注意避光。

注意:标记液体积:对于面积小于5cm²的反应，所需体积是50μL，用50μL乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需 TdT 标记反应液的总体积。对于表面积更大的样本，可成比例地增加试剂体积。

2.3.6盖紧湿盒的盖子，注意避光，防止样本干燥，37℃孵育60min。

2.3.7轻轻吸掉多余液体，用新鲜的PBS 溶液清洗 2 次，每次5min。

注意:如果背景过高，为了降低背景，样本在用PBS清洗后，可再用含0.1% Triton X-100 和5mg/ml BSA 的PBS 洗3次，每次5min，这样可将游离的未反应标记物清除干净。

2.3.8用吸水纸轻轻擦掉样本周围的液体，样本上滴加1滴Antifade Mounting Medium with DAPI (Cat.No. GC26283)

2.3.9用盖玻片盖住载玻片的Antifade Mounting Medium with DAPI，进行封片。

2.3.10立即在荧光显微镜下分析样本，在激发/发射波长 550/570nm下观察橙红色荧光;或在激发/发射波长 356/451nm下观察 DAPI的蓝色荧光。

3. 石蜡包埋组织切片样本

3.1. 样本预处理

3.1.1. 室温下将切片浸入二甲苯脱蜡2次，每次5-10min，以彻底脱掉石蜡。

注意：二甲苯有毒且易挥发，请在独立设置的实验室或者通风橱中进行。低温可能影响二甲苯脱蜡效果。当室温低于20℃时，可将脱蜡时间延长至20min。

3.1.2.  室温下将切片浸入无水乙醇浸泡润洗 2 次，每次5min。

3.1.3.  室温下依次将切片浸入 90%、80%、70%乙醇各1次，每次 3min。

3.1.4. 用PBS 浸泡润洗切片，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围多余的液体。

3.1.5按 1:100的比例，用 PBS 稀释浓度为2mg/mL的 Proteinase K 溶液，使其终浓度为20μg/mL。每个样本上滴加100μL稀释好的 Proteinase K 溶液，使溶液覆盖全部样本区域，37℃孵育15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。

注意: 不同组织或物种的样本反应时间可能不同。Proteinase K通透时间过长会可能会导致组织切片在后续步骤中从载玻片上脱落，过短造成通透处理不充分，影响标记效率。建议进行预实验，确定反应时间。

3.1.6. 用 PBS 溶液中清洗2-3次，每次室温放置5min。

注意: 这一步必须把Proteinase K清洗干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

3.2. 阳性对照（可选步骤）和3.3标记及检测参考细胞涂片样本2.2和2.3

4. 冰冻组织切片样本

4.1. 样本预处理

4.1.1. 将冰冻切片置于长架上，室温晾干20min。

4.1.2.  将载玻片浸没在4%多聚甲醛溶液中，室温固定30min。。

4.1.3.  轻轻去掉多余液体，并用吸水纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。

4.1.4. 用PBS 浸泡润洗切片2次，每次5min。用滤纸小心吸干载玻片上样本周围多余的液体。

4.1.5每个样本上滴加100μL浓度为0.2%的Triton X-100 溶液，使溶液覆盖全部样本区域，室温孵育15-30min。如果通透效果不好，按1:100 的比例，用PBS稀释浓度为2mg/mL的Proteinase K溶液，使其终浓度为20μg/mL。每个样本上滴加100μL稀释好的Proteinase K溶液，使溶液覆盖全部样本区域，37℃孵育10-30min。

注意: 不同组织或物种的样本反应时间可能不同。Proteinase K通透时间过长会可能会导致组织切片在后续步骤中从载玻片上脱落，过短造成通透处理不充分，影响标记效率。建议进行预实验，确定反应时间。

4.1.6. 用 PBS 溶液中清洗2-3次，每次室温放置5min。用滤纸吸干样本周围液体。

注意: 这一步必须把Proteinase K清洗干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

4.2. 阳性对照（可选步骤）和4.3标记及检测参考细胞涂片样本2.2和2.3

5. 悬浮细胞（流式细胞仪）

5.1. 将（3-5）×10⁶个细胞用 PBS洗2次，每次4℃ 1800rpm（300×g）离心 5min。然后用0.5mL PBS重悬。

注意：用于该试剂盒的检测样本最低细胞数目不低于5×10⁵个。

5.2. 加入 5mL 4%多聚甲醛溶液，4℃孵育20min进行细胞固定。

5.3. 4℃ 1800rpm（300×g）离心5min，弃上清，用5mL PBS重悬细胞

5.4. 重复离心并用0.5mL PBS重悬细胞。

5.5. 加入5mL 0.2% Triton X-100溶液，室温条件下通透5min，或者加入5mL冰上预冷的70%乙醇，在-20℃孵育4h。

注意:通透后的细胞折光率会下降，细胞浑浊不易观察，作过程中应小心操作，避免细胞丢失。

5.6. 4℃ 1800rpm（300×g）离心5min，弃上清，用5mL PBS重悬细胞。重复离心并用1mL PBS重悬细胞。

5.7. 转移2×10⁶个细胞至新的1.5mL离心管。

5.8. 4℃ 1800rpm（300×g）离心5min，弃上清，并用100μl 1×Equilibration Buffer（用ddH₂O按1:5的比例稀释 5×Equilibration Buffer）重悬细胞。室温孵育5min。

5.9.在平衡细胞期间，在冰浴和避光条件下依照下表配制标记液。

5.10. 4℃ 1800rpm（300×g）离心5min，弃上清并用50μL TdT标记液重悬细胞。37℃避光孵育 60min。每隔15min轻弹管壁或用微量移液器轻轻重悬细胞。

注意:对于2×10⁶个细胞的一个标准反应，所需体积是50μL。用50μL 乘以反应数目来确定所需 TdT 标记反应液的总体积。

5.11. 加入1mL 20mM EDTA终止反应，用移液器轻柔混匀。

5.12. 4℃ 1800rpm （300×g）离心5min，弃上清，用 1mL 配制于 PBS 中的 0.1% Triton X-100重悬细胞，其中含5mg/mL BSA。重复一次，共洗两次。

注意: 含5mg/ml BSA目的是减少离心造成的细胞损失。

5.13. 用流式细胞仪分析细胞。选择CY3通道进行检测（Ex/Em：550/570nm）

注意:为避免荧光猝灭，请尽快检测。

III 注意事项

    1. 5×Equilibration Buffer中含有表面活性剂，所以在细胞涂片/切片样本的载玻片上滴加会扩散流失，建议实验开始前用PAP Pen圈出染色区域。

   2. 5×Equilibration Buffer使用前，室温静置直至完全溶解。冰冻的平衡液融化后可能会出现钴盐结晶，此为正常现象。使用前涡旋混匀。

   3. CY3-dUTP Mix 和TdT Enzyme 应避免反复冻融和涡旋操作。CY3-dUTP Mix使用前，请置于冰上溶解，待完全溶解后离心，用枪头吹打混匀。TdT Enzyme 对温度较敏感，请严格保存于-20°C，使用前取出，使用后立即放回。

   4. 配制标记工作液和阳性对照DNase I时，建议不要涡旋。

   5. 使用流式细胞仪进行Tunel检测时，若样本为贴壁细胞，凋亡细胞会有部分悬浮于上清中，上清中的细胞也要收集。使用移液枪吹打细胞时，避免细胞损伤和产生过多气泡。

   6. 实验过程中请保持样本的湿润，防止干片造成失败。

   7. 本产品仅限于专业人员的科学研究使用。

   8. 请注意安全事项，遵守实验室试剂操作规范操作。

   9. 本说明书中推荐的条件是通用的，用户可根据不同的样本类型和预实验的结果，对样本处理时间、试剂浓度等条件进行优化，选择最合适的实验条件。

IV 常见问题及解决方案