PEG2000-C-DMG

本方案仅提供指导，实际应用应根据您的需要进行修改。
MC3脂质纳米粒的制备
以FDA批准的针对转甲状腺素蛋白（TTR）mRNA的siRNA疗法为例，所用LNP的脂质摩尔比为D-Lin-MC3-DMA( 目录号：GC35879):DSPC（目录号：GC41832）:胆固醇（目录号：GC17398）:PEG2000-C-DMG（目录号：GC63813） = 50:10:38.5:1.5。此外，RNA与脂质的重量比指定为0.05（wt/wt）。
A:脂质混合制备：
1. 将脂质溶解在乙醇中，制备成10 mg/mL的储备溶液。储存液可储存在-20°C下以备后用。
2. 制备脂质A混合物，每毫升加入548 µL D-Lin-MC3-DMA（10mg/mL）、254 µL胆固醇（10mg/mL）、134 µL DSPC（10mg/mL）和64 µL PEG2000-C-DMG 。充分混合以获得澄清溶液。该混合物含有10mg总脂质。
注意：a：可电离脂质通常是液体。由于其粘度，应始终对其进行称重，而不是依赖自动移液器的体积。
b: 溶液中的胆固醇应保温（>37℃）以保持流动性。及时转移胆固醇溶液以避免冷却。
c：脂质和比例的选择可以根据需要进行更改，这将影响 LNP 特性（大小、多分散性和功效）和所需的 mRNA 量。
B: siRNA准备:
1. 使用 100 mM pH 5 乙酸钠缓冲液制备 166.7 µg/mL siRNA 溶液。
注意：脂质：siRNA 重量比影响包封效率。其他重量比可作为替代配方制备，并应由用户进行相应调整。
C:混合：
实现溶液快速混合的常用方法有三种：移液管混合法、涡流混合法和微流控混合法。所有这些混合方法均可用于各种应用。
但是移液管混合法和涡旋混合法可能会产生更多异质性 LNP，但封装效率较低，并且容易出现变异。微流控装置能够以高度可控、可重复的方式快速混合，从而实现均匀的 LNP 和高封装效率。在这些装置中，乙醇脂质混合物和水溶液在单独的流中快速混合。 LNP 在两种流混合时形成，然后收集到单个收集管中。
1. 移液器混匀方法：
1.1移取 3 mL siRNA 溶液，快速加入 1 mL 脂质混合物溶液中（通常使用乙醇脂质混合物与水性缓冲液的比例为 1:3）。快速上下移液 20-30 秒。
1.2将所得溶液在室温下孵育最多 15 分钟。
1.3混合后，LNP 在 PBS（pH 7.4）中透析 2 小时，使用 0.2 μm 过滤器进行无菌过滤，并储存在 4°C 下。
2.涡旋混匀方法：
2.1在涡旋混合器上以中等速度涡旋 3 mL 的 siRNA 溶液。然后，快速将 1 mL 脂质混合物溶液添加到涡旋溶液中（通常使用乙醇脂质混合物与水性缓冲液的比例为 1:3）。继续涡旋所得分散液 20-30 秒。
2.2将所得溶液在室温下孵育最多 15 分钟。
2.3混合后，LNP 在 PBS（pH 7.4）中透析 2 小时，使用 0.2 μm 过滤器进行无菌过滤，并储存在 4°C 下。
3. 微流体混合方法：
3.1 将 3 mL siRNA 缓冲液和 1 mL 脂质混合物溶液在微流控装置中以 12 mL/min 的总流速混合（一般使用乙醇脂质混合物与水性缓冲液的比例为 1:3）。
3.2 混合后，LNP 在 PBS（pH 7.4）中透析 2 小时，使用 0.2 μm 过滤器进行无菌过滤，并储存在 4°C 下。

注意：可以改变流量比和总流量等参数来微调LNP。

参考文献:

[1] Mashima R, Takada S. Lipid Nanoparticles: A Novel Gene Delivery Technique for Clinical Application. Curr Issues Mol Biol. 2022 Oct 19;44(10):5013-5027.

[2] McKenzie RE, Minnell JJ, Ganley M, Painter GF, Draper SL. mRNA Synthesis and Encapsulation in Ionizable Lipid Nanoparticles. Curr Protoc. 2023 Sep;3(9):e898.