Phosbind Acrylamide

1、Mn²⁺-Phosbind SDS-PAGE

1）、Phosbind SDS-PAGE 试剂的准备

Sol. A：丙烯酰胺溶液	30％（w/v）丙烯酰胺溶液（30％T，3.3％C） 丙烯酰胺------------------------------------------29.0 g N，N'-亚甲基双丙烯酰胺---------------------1.0 g ⇒加入蒸馏水定容至 100mL，过滤。 【保存条件】4℃，避光。
Sol. B：分离胶 Tris-HCl 缓冲液 pH 8.8	1.5 mol/L Tris/HCl 缓冲溶液，pH 8.8（4x 分离胶缓冲液） Tris 碱（MW：121，在 20℃下 pKa = 8.2）------18.2 g 6.0 mol/L HCl（0.19 equivalents of Tris）--------4.85 mL ⇒加入蒸馏水定容至 100mL，过滤。 【保存条件】4℃，避光。
Sol. C：浓缩胶 Tris-HCl 缓冲液 pH 6.8	0.50 mol/L Tris/HCl 缓冲溶液，pH 6.8（4x 浓缩胶缓冲液） Tris 碱-------------------------------------6.06 g 6.0mol/L HCl（0.96 equivalent of Tris 碱）------8.0 mL 蒸馏水-------------------------------------90 mL ⇒用 6.0 mol/L HCl (0.1 mL 左右)调节 pH 至 6.8，加蒸馏水至 100 mL。 【保存条件】4℃。
Sol. D：SDS 溶液	10%（w/v）SDS 溶液 SDS----------------------------------------10.0 g 蒸馏水--------------------------------------90 mL ⇒搅拌，加蒸馏水定容至 100 mL。 【保存条件】4℃。
Sol. E：Phosbind 丙烯酰胺溶液	5.0 mmol/L Phosbind 溶液（含 3%（v/v）甲醇） Phosbind 丙烯酰胺 (MW：595)----------------10 mg（2 mg） 甲醇---------------------------------------------------0.10 mL（0.02 mL） 蒸馏水------------------------------------------------3.2 mL（0.64 mL）   油状产品 Phosbind 丙烯酰胺用 0.1 mL 甲醇完全溶解在小塑料管中。然后该溶液需用移液器加入 3.2 mL 蒸馏水稀释。 注意：如果溶液中出现微量白色粉末状（杂质）不溶物，用 2 mL 离心管离心（2000 x g，10 min）分离即可。 【保存条件】铝箔纸包裹管子，溶液置于 2 mL 离心管中，4℃，避光保存。
Sol. F：MnCl2 溶液	10 mmol/L MnCl2溶液 MnCl2(H2O)4（MW：198）-----------------0.10 g 蒸馏水---------------------------------------------50 mL   注意：不要使用其他阴离子盐如 Mn(NO3)2 或 Mn(CH3COO)2。在碱性水溶液中会形成白色沉淀（Mn(OH)2），并逐渐氧化变成棕色（MnO(OH)），将会使凝胶着色。此外，Mn2+的作用会退化。
Sol. G：APS 溶液	10%（w/v）过硫酸铵溶液 (NH4) 2S2O8（MW：228）------------------10 mg 蒸馏水----------------------------------------------0.10 mL ⇒配好的 Sol. G 可以以合适的量分装，在-20℃下长期储存。
Sol. H：电泳缓冲液	泳缓冲液，pH 8.3（10x 溶液） Tris 碱（0.25 mol/L）-------------------------15.1 g SDS-------------------------------------------------5.0 g 甘氨酸（1.92mol/L）--------------------------72.0 g ⇒加蒸馏水至 500 mL，不需加酸或加碱调节 pH。 只需在使用前将 450 mL 蒸馏水加到 50 mL Sol. H 中，混匀即可。 【保存条件】4℃。
Sol. I：上样缓冲液	上样缓冲液（3x 溶液） 溴酚蓝（BPB）-------------------------------1.5 mg SDS----------------------------------------------0.60 g 甘油----------------------------------------------3.0 mL Sol. C：0.50mol/L Tris/HCl，pH 6.8 --------------3.9 mL 2-巯基乙醇-------------------------------------1.5 mL ⇒加蒸馏水至 10 mL。 【保存条件】-20℃。
Sol. J：固定液	蛋白质酸性固定液（1 L） 乙酸-----------------------------------------0.10 L 甲醇-----------------------------------------0.40 L 蒸馏水--------------------------------------0.50 L
Sol. K：CBB 染色液	考马斯亮蓝染色液（0.5 L） 考马斯亮蓝（CBB）-------------------1.25 g 甲醇-----------------------------------------0.20 L 乙酸-----------------------------------------50 mL 蒸馏水--------------------------------------0.25 L ⇒用甲醇溶解 CBB，再加入乙酸和水。
Sol. L：漂洗脱色液	洗脱色液（1 L） 甲醇-----------------------------------------0.25 L 乙酸-----------------------------------------0.10 L 蒸馏水--------------------------------------0.65 L

2）、分离胶的制备

分离胶溶液（0.375 mol/L Tris，0.1 mmol/L MnCl₂，0.1％SDS）

（以制备 10 mL 含有 12％（w/v）聚丙烯酰胺凝胶、50 μmol/L Phosbind Acrylamide 的溶液为例）

Sol. A：30％（w/v）丙烯酰胺溶液----------------------------------------4.00 mL

Sol. B：1.5 mol/L Tris/HCl 溶液，pH 8.8-------------------------------2.50 mL

Sol. E：5.0 mmol/L Phosbind 溶液---------------------------------------0.10 mL

Sol. F：10 mmol/L MnCl₂ 溶液--------------------------------------------0.10 mL ^*1)

Sol. D：10%（w/v）SDS 溶液---------------------------------------------0.10 mL

TEMED（四甲基乙二胺）---------------------------------------------------10 μL ^*2)

蒸馏水-----------------------------------------------------------------------------3.14 mL

搅拌 2 分钟，去除空气。

Sol. G：10%（w/v）过硫酸铵溶液----------------------------------------50 μL ^*2)

* 1）加入的 MnCl2 溶液是 Phosbind 浓度的两倍（摩尔比）。

* 2）TEMED 和 Sol.G 可用通常使用的浓度，例如以上的添加量。

注意：请优化 Sol. E（Phosbind）和 Sol. A（丙烯酰胺）的浓度。参考 4.优化 Phosbind PAGE 条件。

制备 10mL 分离胶溶液：

Phosbind Acrylamide 浓度	20 μM				50 μM				100 μM
丙烯酰胺浓度	12%	10%	8%	6%	12%	10%	8%	6%	12%	10%	8%	6%
Sol. A (mL)	4	3.33	2.67	2	4	3.33	2.67	2	4	3.33	2.67	2
Sol. B (mL)	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5
Sol. E (mL)	0.04	0.04	0.04	0.04	0.1	0.1	0.1	0.1	0.2	0.2	0.2	0.2
Sol. F (mL)	0.04	0.04	0.04	0.04	0.1	0.1	0.1	0.1	0.2	0.2	0.2	0.2
Sol. D (mL)	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
TEMED (mL)	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01	0.01
蒸馏水(mL)	3.26	3.93	4.59	5.26	3.14	3.81	4.47	5.14	2.94	3.61	4.27	4.94
Sol. G	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05

 

3）、浓缩胶的制备

浓缩胶溶液（0.125 mol/L Tris，0.1% SDS）

（以制备 10 mL（2 mL）4.5％的聚丙烯酰胺凝胶为例）

※括号中显示的是制备 2 mL 所需要的量。

Sol. A：30％（w/v）丙烯酰胺溶液----------------------------------------1.50 mL (0.30 mL)

Sol. C：0.50 mol/L Tris/HCl 溶液，pH 6.8-----------------------------2.50 mL (0.50 mL)

Sol. D：10%（w/v）SDS 溶液---------------------------------------------0.10 mL (20 μL)

TEMED（四甲基乙二胺）---------------------------------------------------10 μL (2 μL) *2)

蒸馏水-----------------------------------------------------------------------------5.84 mL (1.17 mL)

搅拌 2 分钟，去除空气。

Sol. G：10%（w/v）过硫酸铵溶液----------------------------------------50 μL (10 μL) *2)

* 2）TEMED 和 Sol.G 可用通常使用的浓度，例如以上的添加量

4）、样品制备

① 将样品与3 μL Sol. I（上样缓冲液）混合，并加入适量的蒸馏水，使微量离心管中的终体积为 9 μL。

② 95℃加热 5 分钟，然后将溶液冷却至室温。

③ 使用微量移液器上样（如：1.5 μL/孔）。

※β-casein 上样 5〜10μg/孔，即可获得清晰的条带。

5）、电泳

① 安装好电泳装置，电泳槽中加入溶液 H（电泳缓冲液）。

② 从浓缩胶中轻轻拔出梳子，使用微量移液器向每个孔中加样。

③ 将引线连接到电源。在恒流条件（25〜30 mA/凝胶）下跑胶，直到溴酚蓝（BPB）到达分离胶的底部。

（※两块胶时，以 50〜60mA 的电流进行电泳）

※进行蛋白质印迹时，电泳迁移后的步骤请参阅下面的第 II 部分。

6）、CBB 染色·脱色

① 电泳后，将凝胶浸泡在 50 mL 的 Sol. J（用于固定蛋白质的酸性溶液）中。轻轻摇动约 10 分钟。

② 将凝胶浸泡在 50mL 的 Sol. K（CBB 染色溶液）中，轻轻摇动约 2 小时，染色凝胶。

③ 在 50ml 的 Sol. L（漂洗和脱色溶液）中漂洗凝胶 3 次，以除去多余的染色，直到背景足够干净。

④ 拍摄凝胶图片。

 

2、Phosbind SDS-PAGE 凝胶用于蛋白印迹的注意事项

电泳后，电转之前，需要使用螯合剂（EDTA）从凝胶中除去锰离子（Mn²⁺）。此步骤可提高磷酸化和非磷酸化蛋白转移到 PVDF 膜上的转移效率。

  1）电泳后，将凝胶在含有 1〜10 mmol/L EDTA 的普通转移缓冲液中浸泡至少 10 分钟，同时轻轻摇动。（10 分钟×1〜3 次）。

※根据凝胶厚度等调整 EDTA 缓冲液的处理时间和温度（例如：1.5 mm 厚：处理 20 分钟×两次）。

※除了转移缓冲液外，还可以使用 1×电泳缓冲液。

2）接下来，将凝胶在不含 EDTA 的普通转移缓冲液中浸泡 10 分钟，同时轻轻摇动（10 分钟×1 次）。

※强烈推荐使用湿法以实现蛋白从 Mn²⁺ - Phosbind acrylamide 凝胶到PVDF膜的有效转移。（也可以使用半干法）

※对于 Phosbind 凝胶中的磷酸化目的蛋白，必须对印迹条件（如时间和温度）进行优化。

 

3、问题解答

1）、条带弯曲

Phosbind SDS-PAGE 的最常见的问题是“条带弯曲”。特别地，确保样品中不含有 EDTA。

① 预染的 marker：由于泳道之间盐浓度的差异，marker 和样品的条带均会受影响。

⇒不要使用预染 marker。我们建议使用碱性磷酸酶处理的样品或您的目的重组蛋白作为磷酸化的阴性对照，而不是使用预染 marker。

② 酸性样品：条带可能弯曲。

⇒如果溶液为黄色至橙色，即使在加入上样缓冲液后，请加入 Tris 缓冲液直到其为中性（紫色）。

③ EDTA（Mn²⁺被螯合），钒酸，无机盐，表面活性剂等可引起条带弯曲或拖尾。

⇒通过 TCA 沉淀或透析脱盐。

④ 空白泳道：空白泳道可能会导致条带弯曲。

⇒在空白泳道中加入等量的 1x 上样缓冲液。

⑤ 钒酸：竞争结合磷酸可能导致条带弯曲。

⇒使用不同的磷酸酶抑制剂，或通过 TCA 沉淀或透析除去钒酸。

⑥ 将 MnCl₂ 添加到样品中（如终浓度 1 mM）可能改善结果。

⇒如果样品有 EDTA 残留，添加的 Mn²⁺被螯合而不是凝胶中含有的 Mn²⁺。

 

2）、低分离度

① 提高 MnCl₂ 与 Phosbind Acrylamide 的摩尔比可提高分离度（如4:1）。

② 采用 Tris-Tricine 缓冲液作为电泳缓冲液可提高分离度。

3）、蛋白扩散

长时间的恒流转移会导致过热，引起蛋白分解和扩散。

① 如果要使用恒流进行转移，请尝试一些方法，如使用低温室、在使用前彻底冷却转移缓冲液、将冷却剂包裹在转移槽周围（不要使用冰，因为冰可能导致触电）。

②  当可以使用恒定电压时，以恒定电压转移（如 200 V）。转移速度会减慢，但热量产生也会被抑制。

4）、凝胶易碎

丙烯酰胺的浓度低会导致凝胶柔软。

① 5％或更高：提高 N，N'-亚甲基-双丙烯酰胺与丙烯酰胺的比例（例如：24：1）可强化凝胶。

② 加入 3〜5％琼脂糖强化凝胶。

5）、转膜困难

①  EDTA 处理不够充分。延长处理时间，增加含 EDTA 缓冲液的更换频率（如 20 分钟×2 次），或在 EDTA 处理过程中充分摇动。

②  加强电流可能会提高效率（如 200 mA）。

③ 除负染以外的染色如 CBB 染色可能会降低转移效率。

④ 使用低浓度的凝胶可提高转移效率。

⑤ 采取一些方法，如使用较厚凝胶、增加样品使用量等。

⑥ 含 SDS 的转移缓冲液可提高转移效率。当转移到膜上时，直接将 SDS 溶液加入到转移缓冲液以防止起泡（槽法），或在 EDTA 处理和转移之间，将凝胶浸入含有 SDS 的转移缓冲液中并缓慢摇动（如 10 分钟 x1 次）。SDS 的试验浓度为 0.05〜0.20％。

6）、染色的背景较高

EDTA 处理消除凝胶中的金属离子后再染色。

7）、由蛋白质降解引起的条带迁移，而不是由磷酸化诱导进行常规 SDS-PAGE（含有 0 μM 的 Phosbind），验证没有发生条带迁移。

4、Phosbind PAGE 条件优化

为了使用 Phosbind PAGE 获得高质量的结果，需要优化丙烯酰胺和  Phosbind 的浓度。

首先优化丙烯酰胺的浓度（1），其次是  Phosbind 的浓度（2）。

1）、优化丙烯酰胺的浓度

首先，确定进行常规 SDS-PAGE 时目的蛋白迁移到凝胶最底部的最佳丙烯酰胺*浓度。

在 Phosbind PAGE 中，迁移速度比常规 SDS-PAGE（包括非磷酸化蛋白质）慢，因此应检测丙烯酰胺的浓度（见下图）。随着 Phosbind 浓度的增加，迁移速度变慢。

*：进行凝胶电泳，直到上样缓冲液中含有的 BPB 染料到达分离胶的底部。BPB 染料的位置可以定义为 1.0 的 Rf值。在上述运行条件下，调整丙烯酰胺的最佳浓度。当您的目的蛋白在常规 SDS-PAGE 中迁移条带 Rf 值为 0.8 至0.9 时，对于 Phosbind SDS-PAGE，丙烯酰胺的浓度是最佳的。

指示最佳浓度

超过 60 kDa：6％；小于 60kDa：8％。

<高分子量蛋白的情况>向少于 4％丙烯酰胺的凝胶中加入琼脂糖，可以增加凝胶硬度。有报道分离 350 kDa 的数据（请参阅第五部分“常见问题解答”中的“Phosbind Acrylamide 的分离”）。此外，还可以通过增加 N，N'-亚甲基双丙烯酰胺的含量（如 5％丙烯酰胺[24:1]）来提高凝胶硬度。

2）、优化  Phosbind 的浓度

其次，优化  Phosbind 的浓度。请依次从最低到最高摸索出最佳浓度。如：20 μM→50 μM→100 μM。

【细胞裂解液】

如果您的样品中含有多种蛋白（如细胞裂解液），Phosbind 的浓度应在 5 至 25 μM 之间。然而，如果目的蛋白浓度较低（如非过表达体系），则建议使用较高浓度，如 100 μM。

※最佳浓度取决于蛋白。请根据每个目的蛋白的具体情况摸索合适的条件。

 

5、常见问题解答

1）使用此产品可以分离多大（kDa）的蛋白？

A：已经有报道使用 20 μM Phosbind、3％丙烯酰胺和 0.5％琼脂糖^*分离了 350 kDa 的磷酸化蛋白。

*加入琼脂糖以增加凝胶强度

2）如何改善分离度？

A：通常情况下，Phosbind 浓度越高，分离能力越好。然而，增加 Phosbind 的浓度也导致蛋白质整体的迁移速度成比例地下降。

  3）是否可以使用 CBB 以外的凝胶染色技术？

A：是的，凝胶也可以通过负染、银染和荧光染色进行染色。

4）凝胶容易破裂，我该怎么办？

A：丙烯酰胺的浓度低会导致凝胶柔软。可以通过提高亚甲基双丙烯酰胺与丙烯酰胺的相对比例（如

24：1）解决这个问题。

5）配制好的含 Phosbind 的凝胶可以存放多久？

A：凝胶会在几天内变质，因此建议现用现配。

6）溶于甲醇和水的母液可以保存多久？

A：据报道，冷藏避光条件下保存 6 个月，效果无明显下降。

7）按照实验流程中的方法配制 Phosbind 溶液，结果出现混浊，这正常吗？

A：正常。混浊是由甲醇造成的，静置一会儿溶液就会变得澄清。

8）可否仅用水来溶解 Phosbind？

A：Phosbind 溶于水，虽然与溶解在含甲醇的水中相比需要更多的时间。如果不能完全溶解，离心取上清使用。

9）可使用哪种预染 marker？

A：Phosbind 凝胶使用预染 marker 常常导致条带弯曲，在含有该 Marker 的溶液和其他溶液之间至少需要留一条空白泳道。

10）磷酸化反应液中存在 ATP，是否会对电泳造成影响？

A：浓度为 2.0 mM 的 ATP 没有什么特别的影响，使用上限还不清楚。

11）在 Phosbind SDS-PAGE 中出现条带迁移，如何确定这是磷酸化的象征还是蛋白降解造成的？

A：请进行常规 SDS-PAGE（不加 Phosbind），验证蛋白完整性。

应用&特点	高选择性：Phosbind 能够特异性地结合磷酸化基团，可识别所有氨基酸的磷酸化。 广泛适用：适用于蛋白质大小在30 KDa 到 130 KDa 之间的样品。 稳定性：Phosbind 与金属离子（如 Zn2+ 或 Mn2+）结合后，形成一个半封闭的空间，能够牢固而稳定地结合磷酸基团。 生理条件：在中性 pH 值范围（pH 6~8）下，Phosbind 可以有效结合磷酸基团。
运输方式	蓝冰运输或根据您的需求运输。
储存条件	2-8℃，可稳定长达12个月。
用途	仅供研究使用!不能用于人体。