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Phosbind Biotin BTL-104

目录号 : GK10006

Phosbind Biotin BTL-104是一种单生物素化的 Phosbind 衍生物,包含ZnCl2,可用于检测磷酸肽和纯化的磷酸化蛋白。Phosbind是一种能与磷酸离子特异性结合的功能分子。

Phosbind Biotin BTL-104 Chemical Structure

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Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.

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Description

Phosbind is a new type of phosphate-binding tag and functional molecule that can specifically bind phosphate ions under neutral pH (physiological pH) conditions. Phosbind is a bicyclic metal complex (1,3-bis[bis(pyridin-2-ylmethyl) amino]propan-2-olato dizinc(II) complex), which is a selective phosphate binding tag in In an aqueous solution with a neutral pH, in the case of Zn2+, its Kd value for phenylphosphate dianion (PH-OPO32-) is 25 nM. Therefore, various methods for phosphoproteomic studies using Phosbind derivatives were developed. Here, we introduce a new application of Phosbind, which is the chemiluminescence detection of all phosphorylated proteins on electroblotted PVDF membranes using biotinylated Phosbind zinc(II) complex. 

Phosbind Biotin provides a sensitive method for detecting phosphorylated proteins on PVDF membranes that requires streptomycin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) and chemiluminescent detection reagents.

Phosbind 是一种新型的磷酸盐结合标签和功能分子,在中性pH(生理pH)条件下可以特异性结合磷酸离子。Phosbind 是一种双环金属络合物(1,3-bis[bis(pyridin-2-ylmethyl) amino]propan-2-olato dizinc(II) complex),是一种选择性的磷酸结合标签,在中性pH的水溶液中,在存在Zn2+的情况下其对苯基磷酸酯二价阴离子(PH-OPO32-)的Kd 值为25 nM。因此,用Phosbind衍生物进行磷酸化蛋白质组研究的各种方法被开发出来。这里,我们引入了Phosbind 的一种新应用,即用生物素化Phosbind 锌(II) 复合物对电印迹PVDF膜上的全部磷酸化蛋白进行化学发光检测。

 Phosbind Biotin BTL-104提供了一种检测PVDF膜上磷酸化蛋白的敏感方法,该方法需要链霉素偶联辣根过氧化物酶(HRP)和化学发光检测试剂。

References:
[1] Fanqiang Meng, Fengxia Lu, et al. "Acetate and auto‐inducing peptide are independent triggers of quorum sensing inLactobacillus plantarum." Mol Microbiol. 2021 Jul;116(1):298-310. PMID: 33660340
[2] Haijing Guo, Jen-Hsuan Wei, et al. "TPX2 activation by GM130 controls astral microtubule formation and spindle orientation." bioRxiv. March 17, 2020.

实验参考方法

本方案仅提供一个指导,请根据您的具体需要进行修改。

1、Phosbind Biotin BTL-104试剂的准备:

Sol. A: 三氮唑缓冲盐水

三氮唑缓冲盐水 (10xTBS, 1 L, pH 7.5)

Tris (0.10 mol/L) -----------------------------------------------12.1 g

NaCl (1.0 mol/L) -----------------------------------------------58.4 g

蒸馏水----------------------------------------------------------0.9 L

用于将pH调整至7.5的2 mol/L盐酸--------------------------适量

用于配制1升溶液的蒸馏水-------------------------------------适量

Sol. B: Tween 20 溶液

10% (v/v) Tween 20 溶液 (50 mL)

Tween 20 ----------------------------------------------------------5 mL

蒸馏水---------------------------------------------------45 mL

Sol. C: TBS-T

1xTBS-T (1 L)

溶液 A ----------------------------------------------------------100 mL

溶液B -----------------------------------------------------------10 mL

蒸馏水------------------------------------------------890 mL

Sol. D: Phosbind Biotin BTL-104 甲醇溶液

Phosbind Biotin BTL-104甲醇溶液

Phosbind Biotin BTL-104 (MW: 767)--------------------------10 mg

甲醇-----------------------------------------------0.13 mL

【储存】在4℃的黑暗处储存。

Sol. E: Phosbind Biotin BTL-104 溶液

Phosbind Biotin BTL-104 溶液 (10 mmol/L)

溶液 D-------------------------------------------------------0.13 mL

溶液 C-------------------------------------------------------1.17 mL

【储存】在4℃的黑暗处储存。

Sol. F:氯化锌水溶液

 

10 mmol/L氯化锌水溶液 (50 mL)

ZnCl2 (FW. 136.3)---------------------------------- 68.15m g

蒸馏水--------------------------------------------------50 mL

Sol. G: HRP-偶联链霉亲和素溶液

HRP-偶联链霉亲和素 

 

 

2、Phosbind Biotin结合HRP-偶联链霉亲和素溶液的制备:

1)      混合以下溶液,得到的溶液(溶液H)在室温静置30min。

溶液C (1xTBS-T) ------------------------------------------------------ 469μL

溶液E (Phosbind Biotin BTL-104溶液) * -------------------------- 1 ~ 10μL

溶液F (10 mmol/L ZnCl2) --------------------------------------------- 2 ~ 20μL

溶液G (HRP-偶联链霉亲和素) ------------------------------------- 1μL

2)      将溶液H加入离心过滤器杯(NMWL = 30,000,NanosepTM 30K)。使用附带的盖子密封。

3)      室温下离心(14,000 x g)20min,去除多余的Phosbind Biotin。

4)      杯中剩余的溶液(<10μL)用30 mL的溶液C (1xTBS-T) 进行稀释,得到溶液Phosbind Biotin-SH(Zn2+- Phosbind Biotin结合HRP-偶联链霉亲和素的溶液)。

注:

* [ Phosbind Biotin BTL-104] >> [HRP-偶联链霉亲和素]

溶液Phosbind Biotin-SH中的Phosbind Biotin结合HRP-偶联链霉亲和素在4℃条件下稳定保存30天。

 

3、Phosbind Biotin结合HRP-偶联链霉亲和素蛋白印迹实验步骤:

1)      在保鲜盒中用溶液C (1xTBS-T)浸泡一块蛋白质印迹的聚偏氟乙烯膜(PVDF膜),请戴上橡胶手套。低速震荡膜至少1h,确保膜不会附着在保鲜盒上。注意不要让膜变干。

2)      使用溶液 Phosbind Biotin-SH(每5 cm2约1 mL)在一个塑料袋中孵育膜,低速震荡袋子30min。

3)      从袋中取出膜,用溶液C(每5 cm2约10 mL)在保鲜盒中洗涤2次,每次室温下低速震荡5min。确认膜不会附着在保鲜盒上,注意不要让膜变干。

4)      使用适量的化学发光试剂(例如,Ultra High Sensitivity ECL Kit GK10008),观察化学发光信号,可以使用X光胶片或图像分析仪。

 

4、重新探测蛋白质印迹的PVDF膜的步骤如下:

Sol. K: Tris-HCl 缓冲液

0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液(1 L, pH 6.8)

Tris ----------------------------------------------------------- 60.6 g

蒸馏水--------------------------------------------------0.8 L

6 mol/L盐酸(用于调整pH至6.8)------------------------ 适量

用于配制1升溶液的蒸馏水-------------------------------------适量

Sol. L: SDS 溶液

10% (w/v) aqueous SDS溶液(1 L)

SDS ----------------------------------------------------------100 g

用于配制1升溶液的蒸馏水-------------------------------------适量

Sol. M: 去离子缓冲液

去离子缓冲液(1 L)

溶液K --------------------------------------------------------125 mL

溶液L -------------------------------------------------------200 mL

2-巯基乙醇----------------------------------------- 7 mL

蒸馏水---------------------------------------------668 mL

1)      被Zn2+-Phosbind Biotin和HRP-偶联链霉亲和素探测的蛋白质印迹的PVDF膜在保鲜盒中加入溶液C (1xTBS-T, 25 mL/5 cm2) 浸没。低速震荡膜至少1h。注意不要让膜变干。如果膜变干,可以在此去离子处理前用甲醇浸泡膜。

2)      在保鲜盒中加入溶液M (1xTBS-T, 25 mL/5 cm2) 浸没膜,室温低速震荡20min。确认膜不会附着在保鲜盒上。

3)      在保鲜盒中加入溶液C(1xTBS-T, 25 mL/5 cm2) 浸没膜,室温低速震荡1h,洗3次。确认膜不会附着在保鲜盒上,注意不要让膜变干。

4)      采用适当的蛋白质进行膜封闭,然后采用适当的抗体重新探测。进行化学发光分析。

 

5、故障排除

 

1) 溶液E中的 Phosbind Biotin (10μL) 与溶液G中的 Streptavidin-conjugated Horseradish Peroxidase (1μL) 相比是大量过量的。我们使用更少的Phosbind Biotin(例如,1μL溶液E)和相同量的溶液G(1μL)得到了几乎相同的结果。用户应该调整溶液D 的体积以获得所需的灵敏度或节省费用。如果减少溶液E 的体积,则无需改变锌(II) 溶液(溶液F)的体积。

 

2) 如果膜未充分浸泡在溶液C 中,则背景信号会高且斑点状。此外,可能观察不到蛋白质信号。确认膜不会排斥溶液C。

 

3) 强烈推荐使用 PVDF 膜进行Phosbind Biotin方法。

 

【注意】:上述内容提供了针对使用 Phosbind Biotin方法的可能问题的解决方案。用户在进行实验时应仔细检查并根据实际情况调整实验条件。

 

6、常见问题解答

 

1) 灵敏度水平如何?

答:在纳克级别。使用高发光试剂,如 ImmunoStar LD。

 

2) 除了此产品,我们是否需要其他试剂?

答:需要准备HRP-偶联链霉亲和素溶液。

 

3) Phosbind Biotin BTL-104可以使用多少次?

答:取决于使用频率。请参考以下作为指南。BTL-104:130~1300 次

 

4) 磷酸化的蛋白质可以进行检测吗?

答:可以进行基于条带密度的半定量检测。

 

5) 是否可以确定结合的磷酸基团的数量?

答:不可以。

 

6) 我能否去掉Phosbind Biotin BTL-104的抗体?

答:是的,可以。将其与含有62.5 mM Tris-HCl(pH 6.8)、2% (w/v) SDS 和 0.1 M 2-巯基乙醇的溶液混合,并摇动混合物15min。然后,用1xTBS-T洗3次每次10min冲洗混合物。

 

7) 推荐使用哪种膜?

答:我们推荐使用 PVDF 膜。

 

8) 使用Phosbind Biotin BTL-104是否需要封闭?

答:不需要。封闭会导致灵敏度下降。

产品组成

Components Formula M.Wt Solubility
Phosbind Biotin BTL-104 C40H50N10O4S 766.95 DMSO: >32.3 mg/mL
ZnCl2 ZnCl2 136.3 Water: >2 mg/mL

功能属性

应用&特点● 无辐射。

● 无需PVDF膜的封闭处理。

● Phosbind 的特异性结合与氨基酸种类、序列无关。

● 可适用于免疫印迹和质谱分析等后续工作。

● Phosbind BTL母液可稳定保存至少6个月。

● 实验流程与使用HRP标记抗体相类似。
运输方式蓝冰运输或根据您的需求运输。
储存条件2-8℃,可稳定长达12个月。
用途仅供研究使用!不能用于人体。

产品文档

Quality Control & SDS

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