Rhod-2 AM
(Synonyms: Rhod-2 Acetoxymethyl ester) 目录号 : GC30506Rhod-2 AM是Rhod-2的一种乙酰甲酯衍生物，Rhod-2 AM可透过细胞膜，通过其乳糖酶切割产生具有不透过膜的Rhod-2，并留在细胞内发挥相应的生理功能。
Cas No.:145037-81-6
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
Rhod-2 AM is an acetyl methyl ester derivative of Rhod-2, which is permeable to cell membrane and can be cut by its lactase to produce Rhod-2 with non-permeable membrane and remain in the cell to play corresponding physiological functions. Rhod-2 is a high-affinity Ca2+ fluorescence probe with an excitation wavelength of 552nm and an emission wavelength of 581nm after binding with Ca2+. Rhod-2 is suitable for the detection of Ca2+ levels in cells or tissues with high levels of autofluorescence signals, and can also be used to detect calcium ion release caused by photoactivation of photoreceptors and cage-locked calcium ion chelators[1-3].
Rhod-2/AM can be used to assess the effect of intracellular mitochondrial Ca2+ concentration[4]. The endoplasmic reticulum calcium level of BCPAP cells could be determined by Rhod-2/AM calcium fluorescence probe[5]. Rhod-2 AM was loaded into brain slices of adult mice (2-5 months) from a knockin model (ChR2(C128S)) expressing channels of rhodopsin 2 in cortical astrocytes to induce a powerful Ca2+ response to light stimulation[6].
References:
[1]. Brisac C, Téoulé F,et,al. Calcium flux between the endoplasmic reticulum and mitochondrion contributes to poliovirus-induced apoptosis. J Virol. 2010 Dec;84(23):12226-35. doi: 10.1128/JVI.00994-10. Epub 2010 Sep 22. PMID: 20861253; PMCID: PMC2976416.
[2]. Territo PR, Heil J, et,al. Fluorescence absorbance inner-filter decomposition: the role of emission shape on estimates of free Ca(2+) using Rhod-2. Appl Spectrosc. 2007 Feb;61(2):138-47. doi: 10.1366/000370207779947530. PMID: 17331304.
[3]. MacGowan GA, et,al. Rhod-2 based measurements of intracellular calcium in the perfused mouse heart: cellular and subcellular localization and response to positive inotropy. J Biomed Opt. 2001 Jan;6(1):23-30. doi: 10.1117/1.1316091. PMID: 11178577.
[4]. Jiang M, Zhang YX, et,al. Piezo1 channel activation stimulates ATP production through enhancing mitochondrial respiration and glycolysis in vascular endothelial cells. Br J Pharmacol. 2023 Jul;180(14):1862-1877. doi: 10.1111/bph.16050. Epub 2023 Feb 27. PMID: 36740831.
[5]. Zhang L, Cheng X, et,al. Curcumin induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in human papillary thyroid carcinoma BCPAP cells via disruption of intracellular calcium homeostasis. Medicine (Baltimore). 2018 Jun;97(24):e11095. doi: 10.1097/MD.0000000000011095. PMID: 29901626; PMCID: PMC6023948.
[6]. Balachandar L, Montejo KA, et,al. Simultaneous Ca2+ Imaging and Optogenetic Stimulation of Cortical Astrocytes in Adult Murine Brain Slices. Curr Protoc Neurosci. 2020 Dec;94(1):e110. doi: 10.1002/cpns.110. PMID: 33285041; PMCID: PMC8042830.
Rhod-2 AM是Rhod-2的一种乙酰甲酯衍生物，Rhod-2 AM可透过细胞膜，通过其乳糖酶切割产生具有不透过膜的Rhod-2，并留在细胞内发挥相应的生理功能。Rhod-2是一种高亲和力的可见光激发波长Ca2+荧光探针，与Ca2+结合后的激发波长为552nm,发射波长为581nm,适用于具高水平自荧光信号的细胞或组织Ca2+水平检测，也可用来检测由光感受器和笼锁钙离子螯合剂光激活导致的钙离子释放[1-3]。
Rhod-2 AM可用于评估细胞内线粒体Ca2+浓度的影响[4]。Rhod-2 AM钙荧光探针可检测BCPAP细胞内质网钙水平[5]。可以将Rhod-2 AM加载到来自皮质星形胶质细胞中表达通道视紫红质-2 (ChR2(C128S))的敲入模型(2-5个月)的成年小鼠脑切片中，可以观察到对光刺激的强大Ca2+反应[6]。
本方案仅提供一个指导，请根据您的具体需要进行修改。
1.制备染色液
(1)配置储存液: 在高质量无水DMSO中制备浓度为1-10mM的AM酯储存液；
注意:
① 未使用的储存液分装后在-20℃或-80°C避光保存，避免反复冻融；
② 乙酰氧基甲基酯(AM)易吸潮，冰箱取出后请在干燥的环境放至室温后再开封。开封前请将其短暂离心，以保证粉末落入管底。
(2)配置工作液:用合适的缓冲液(如:无血清和酚红的培养基或PBS)稀释储存液，配制浓度为1-10μM的工作液。
注意:
① AM酯染色工作液制备时，有时需要往储存液中加入适量的20% Pluronic F-127溶液，以增强AM探针的水溶性；
② Pluronic F-127可以防止AM探针在溶液中聚合并促使探针更好进入细胞。但PluronicF-127可降低AM探针的稳定性，因此只建议在配制工作液时加入，不建议加入储存液长期保存；
③ 配制20%(w/v) Pluronic F-127母液:称取100mg Pluronic F-127粉末(货号: GB30090)，加入500μl DMSO，40-50℃加热20-30min，室温保存。如有结晶析出可重新加热溶解，不影响使用；
④ （可选）GLPBIO提供溶解好的Pluronic F-127(20% Solution in DMSO) ，货号：GB30091；
⑤ 添加等体积20% Pluronic F-127溶液到储存液中，从而使Pluronic F-127的最终工作浓度约为0.02%；
⑥ 请根据实际情况调整工作液浓度，现用现配，避免反复冻融。
2.细胞悬浮染色
(1)悬浮细胞：经4°C、1000g离心3-5分钟，弃去上清液，使用PBS或其他缓冲液清洗两次，每次5分钟；
(2)贴壁细胞：使用PBS或其他缓冲液清洗两次，加入胰酶消化细胞，消化完成后经1000g离心3-5min；
(3)加入染料工作溶液重悬细胞，室温或低于室温条件下避光孵育20min-2h。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索；
注：
① AM酯类染料在大部分细胞中的推荐工作浓度为4-5μM，具体使用浓度需根据实验要求进行优化。为了避免过度加载造成细胞毒性，建议在取得有效结果的基础上尽量使用最低探针浓度；
② （可选）如果细胞内含有机阴离子转运体，可能需要在细胞培养基中加入丙磺舒(GC16825，Probenecid，1-2.5mM)或磺吡酮(GC11049 ，Sulfinpyrazone，0.1-0.25mM)，以降低去酯化 探针的泄露水平。丙磺舒或磺吡酮储存液偏碱，因此加入培养基后需要重新调整pH；
③ 若使用含血清的培养基，血清内酯酶会降解AM，从而降低染料加载效果；而含酚红培养基会使本底值略偏高，建议加入染色工作液前，对细胞清洗2~3次；
④ 降低探针加载温度可能会降低探针的区室化现象；
⑤ 在染色前用硼氢化钠（NaBH4）化学还原Rhod-2 AM已被发现可增强该染料的线粒体定位。添加少量过量的固体或甲醇溶液形式的硼氢化钠孵育10分钟或反应至混合物出现无色。
(4)孵育结束后，经1000g离心5分钟，去除染色液，加入PBS或其他缓冲液清洗2-3次，去除残留探针；
(5)室温再孵育30min以保证细胞内AM的完全去酯化。
3.细胞贴壁染色
(1)在无菌盖玻片上培养贴壁细胞；
(2)从培养基中移走盖玻片，吸出过量的培养基，将盖玻片放在潮湿的环境中；
(3)从盖玻片的一角加入100μL的染料工作液，轻轻晃动使染料均匀覆盖所有细胞；
(4) 室温或低于室温条件下避光孵育20min-2h。不同细胞最佳孵育时间不同，请根据具体实验需求自行摸索；
(5)孵育结束后吸弃染料工作液，使用PBS或其他缓冲液清洗盖玻片2~3次；
(6)室温孵育30min。
4.显微镜检测：Rhod-2 AM的最大激发/发射波长为557/581nm。
注意事项：
1）荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。
2）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
| Cas No. | 145037-81-6 | SDF | |
| 别名 | Rhod-2 Acetoxymethyl ester | ||
| 化学名 | 9-[4-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]-3-[2-[2-[bis[2-[(acetyloxy)methoxy]-2-oxoethyl]amino]phenoxy]ethoxy]phenyl]-3,6-bis(dimethylamino)-xanthylium, monobromide | ||
| Canonical SMILES | CN(C1=CC2=[O+]C3=C(C=CC(N(C)C)=C3)C(C4=CC=C(N(CC(OCOC(C)=O)=O)CC(OCOC(C)=O)=O)C(OCCOC5=CC=CC=C5N(CC(OCOC(C)=O)=O)CC(OCOC(C)=O)=O)=C4)=C2C=C1)C.[Br-] | ||
| 分子式 | C52H59N4O19 • Br | 分子量 | 1124.0 |
| 溶解度 | DMSO: Soluble | 储存条件 | Store at -20°C, protect from light |
| General tips | 请根据产品在不同溶剂中的溶解度选择合适的溶剂配制储备液；一旦配成溶液，请分装保存，避免反复冻融造成的产品失效。 储备液的保存方式和期限：-80°C 储存时，请在 6 个月内使用，-20°C 储存时，请在 1 个月内使用。 为了提高溶解度，请将管子加热至37℃，然后在超声波浴中震荡一段时间。 |
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| Shipping Condition | 评估样品解决方案：配备蓝冰进行发货。所有其他可用尺寸：配备RT，或根据请求配备蓝冰。 | ||
| 制备储备液 | |||
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1 mg | 5 mg | 10 mg |
| 1 mM | 0.8897 mL | 4.4484 mL | 8.8968 mL |
| 5 mM | 0.1779 mL | 0.8897 mL | 1.7794 mL |
| 10 mM | 0.089 mL | 0.4448 mL | 0.8897 mL |
| 第一步：请输入基本实验信息（考虑到实验过程中的损耗，建议多配一只动物的药量） | ||||||||||
| 给药剂量 | mg/kg |  |
动物平均体重 | g | |
每只动物给药体积 | ul | |
动物数量 | 只 |
| 第二步：请输入动物体内配方组成（配方适用于不溶于水的药物；不同批次药物配方比例不同，请联系GLPBIO为您提供正确的澄清溶液配方） | ||||||||||
| % DMSO % % Tween 80 % saline | ||||||||||
| 计算重置 | ||||||||||
计算结果:
工作液浓度： mg/ml；
DMSO母液配制方法： mg 药物溶于 μL DMSO溶液（母液浓度 mg/mL，
体内配方配制方法：取 μL DMSO母液，加入 μL PEG300，混匀澄清后加入μL Tween 80，混匀澄清后加入 μL saline，混匀澄清。
1. 首先保证母液是澄清的；
2.
一定要按照顺序依次将溶剂加入，进行下一步操作之前必须保证上一步操作得到的是澄清的溶液，可采用涡旋、超声或水浴加热等物理方法助溶。
3. 以上所有助溶剂都可在 GlpBio 网站选购。
Quality Control & SDS
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- SDS (Safety Data Sheet)
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