TRIzol NC Reagent
目录号 : GK20010TRIzol NC Reagent是无需使用氯仿的总RNA提取试剂，广泛适用于培养细胞、动物组织、植物组织等样本。
Sample solution is provided at 25 µL, 10mM.
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自备材料：
异丙醇，75%乙醇(RNase-free ddH2O配制)，RNase-free ddH2O。
Ⅰ.实验前的准备
提取RNA的关键是抑制细胞和环境中的RNA降解酶，防止所用设备和试剂中RNA降解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性清洁手套和口罩；使用特殊的实验台进行RNA操作；操作过程中避免说话等。上述方法可以防止实验者的汗液和唾液的RNA降解酶污染。
注意：
1. 尽量使用一次性无酶无菌塑料耗材。如果使用玻璃器皿，应在使用前用37℃的0.1%DEPC水溶液处理12小时，然后在120℃高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。
2. 用于RNA实验的试剂必须采用干热（180℃，60min）灭菌或在DEPC水处理和灭菌后的玻璃容器中使用上述方法灭菌（也可使用无菌无核酶的一次性塑料容器），使用的无菌水必须用0.1%DEPC处理后再高压灭菌。
3. RNA实验用试剂和无菌水应专用，避免混合后交叉污染。
4. 本产品仅供科学研究使用，不得用于临床医学诊断及其他非合理用途。
5. 本产品中含有苯酚，具有毒性和腐蚀性，使用时应穿戴防护物品，如防护服装、手套、眼罩、面罩等。如果不慎接触到眼睛，应立即用大量的清水冲洗并前往医院治疗；接触到皮肤，请立即用大量去垢剂和清水冲洗，如仍有不适，请前往医院治疗。
Ⅱ实验操作
1. 样本处理
1.1动物/植物组织
1.1.1将新鲜组织剪碎，用液氮速冻，迅速转移至液氮预冷的研钵中，用研磨杵迅速研磨，期间不断加入液氮，直至研磨成粉末状。
注：研磨不彻底会影响RNA的得率和质量。
1.1.2 将研磨成粉的样品转移至离心管中，大约每50mg组织加入500μL TRIzol NC Reagent，涡旋振荡至充分裂解，室温静置5min。
注：每500μL TRIzol NC Reagent最多可裂解50mg动物/植物组织，过多的样本量可能会导致裂解不充分，并使产物纯度降低。肝脏、脾脏、肾脏等组织DNA/RNA含量丰富，过多样本量还会导致gDNA残留或产量降低。
注：若没有液氮研磨条件，可将新鲜组织尽量剪碎浸泡在TRIzol NC Reagent中，用电动匀浆器高速匀浆至组织块彻底裂解。
1.1.3 (优选)11,200rpm (12,000xg)室温离心5min。小心吸取上清至新的1.5ml离心管，切勿吸取沉淀。
注：若样本含有较多蛋白质、脂肪、多糖或肌纤维、植物块茎等，可离心去除不溶物质，离心得到的沉淀包含细胞膜、多糖、高分子量DNA等，而RNA存在于上清中。提取脂肪含量较高的组织样本时，若上层含有大量油脂，应去除。转移上清进行后续操作。
1.2悬浮细胞
1.2.1离心收集细胞，弃尽上清，每1x106-1x107个细胞加入500μL TRIzol NC Reagent。
1.2.2涡旋振荡或用移液器反复吹打直至充分裂解，室温静置5min。
注：对于冻存细胞，加入TRIzol NC Reagent应立即进行振荡，否则会导致裂解不充分。
1.3 贴壁细胞
1.3.1弃去细胞培养液，用1xPBS清洗一次，弃尽废液。
1.3.2常规6孔板每孔或直径3.5cm平皿(约10cm2培养面积)的细胞加入500μL TRIzol NC Reagent，使之充分覆盖细胞表面，然后用移液器反复吹打细胞使其脱落。
注：对于贴壁牢固的细胞(细胞团)可采用细胞刮或者洁净的枪头剥离，或将TRIzol NC Reagent 增加至1ml，亦可在加入TRIzol NC Reagent 之前用胰酶将细胞消化下来，然后按照悬浮细胞处理。
1.3.3 将裂解液转移至1.5ml离心管，涡旋振荡或用移液器反复吹打直至充分裂解，室温静置5 min。
2. RNA提取
2.1所得裂解液中加入Dilution Buffer。
2.1.1动物/植物组织：每500μL TRIzol NC Reagent加入100μL Dilution Buffer；涡旋振荡至溶液充分混匀，室温静置5min。
2.1.2细胞：每500μL TRIzol NC Reagent加入150μL Dilution Buffer。盖紧离心管盖，涡旋振荡至溶液充分混匀，室温静置5min。
注：振荡时注意使溶液充分混匀为均一溶液，混匀不彻底影响RNA提取效率和杂质去除效率。
2.2 11,200rpm（12,000xg）室温离心15 min。
2.3 小心取出离心管。此时样本中蛋白质、DNA、多糖等杂质沉淀到管底，RNA分布在上层溶液中，小心吸取上清溶液(约500μL)至一个新的离心管中 。
注：上层溶液的体积约占总体积的90%，用500μL TRIzol NC Reagent进行提取，上层溶液约为500μL；触碰到下层沉淀会导致基因组及杂质污染。
注：部分样本上清轻微浑浊或有颜色，可继续后续操作，不影响产量和纯度。
注：组织投入量为50mg时，吸取上清溶液体积建议减少至450μL，避免吸到下层沉淀。
2.4 在得到的上清溶液中加入等体积异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温静置10min。
2.5 11,200 rpm(12,000xg)室温离心10min，离心后在管侧和管底可以看见白色凝胶状RNA沉淀，小心弃去上清，勿丢失沉淀。
注：RNA含量少会导致沉淀不明显，小心弃去上清，勿丢失沉淀。
注：为减少杂质残留，此步骤尽可能将上清弃干净。
2.6 离心管中加入1ml 75%乙醇(RNase-free ddH2O配制)清洗沉淀。轻弹管底，让沉淀悬浮起来，上下颠倒数次。
2.7 9,100rpm (8,000xg)室温离心3min，弃去上清，勿丢失沉淀。
2.8 重复步骤6和7一遍，弃尽上清。
注：为减少杂质残留，应尽可能的将上清液弃干净。建议弃去大部分上清后，短暂离心将所有液体甩至管底，再用10μL移液器将剩余液体吸掉，注意不要吸到沉淀。
2.9 超净工作台中吹干沉淀，加入20-100μL RNase-free ddH2O溶解沉淀，室温涡旋3min(或使用移液器反复吹打)，使RNA沉淀充分溶解。提取的RNA产物可以分装后在-85~-65℃长期保存，在-30~-15℃短期保存。
注：通常，RNA沉淀晾干2-3min即可，不要过度晾干，RNA完全干燥后会很难溶解。RNA产物器要充分溶解，否则可能导致浓度定量失准。
Ⅲ 常见问题解决方案
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常见问题 |
原因 |
解决方案 |
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RNA产物溶解不完全 |
1.干燥时间过长 |
75%乙醇清洗后用10uL移液枪弃尽上清，控制干燥时间，避免过分干燥 |
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2.产物量过多 |
增加RNase-free ddH2O投入量，延长溶解时间或55 ~ 60℃水浴加热2 - 3min |
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3.杂质过多 |
样本充分裂解后，离心取上清后再进行后续操作 |
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RNA降解 |
1.存在RNase污染 |
确保所有离心管、枪头及相关溶液都必须无RNase污染；做好防护工作，戴口罩和一次性干净手套，并在单独的洁净区操作 |
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2.样本保存不当或样本保存时间过久 |
采用新鲜样本或经液氮速冻后保存于-85 ~ -65℃的样本 |
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3.样本反复冻融 |
样本保存时，建议分装后保存，避免因反复冻融导致的降解；从液氮中取出的样本应迅速加入裂解液并充分混合均匀，防止样本因置于室温时间过长或与裂解液混合不均匀导致RNA降解 |
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4.电泳原因 |
电泳前将电泳槽用3％双氧水浸泡20min，然后用RNase-free ddH2O进行冲洗；电泳缓冲液用RNase-free ddH2O配制；更换新RNA专用的Loading Buffer |
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抑制下游或纯度低 |
1.蛋白质污染 |
减少样本起始投入量；增加TRIzol NC Reagent体积；勿触碰蛋白质沉淀 |
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2.多糖污染 |
减少样本起始投入量 |
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3.脂肪污染 |
建议增加1.1.3优选步骤 |
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4.盐残留 |
增加75%乙醇漂洗次数 |
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5.A260/230过低 |
增加75%乙醇漂洗次数 |
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基因组 DNA污染 |
1.样本投入量过高 |
减少样本起始投入量 |
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增加TRIzol NC Reagent体积 |
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样本裂解时，加适量HAc (每500μl TRIzol NC Reagent加5μl) |
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逆转录时选择含有基因组去除模块的逆转录试剂，推荐使用SuperFast RT Master Mix for qPCR (gDNA remover)(Cat.No. GK10031) |
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设计引物时选用跨内含子的引物，避免基因组DNA模板参与扩增反应 |
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加入异丙醇离心后看不见沉淀 |
1.样本投入量低或RNA 含量低 |
加入异丙醇后在2 ~ 8℃或-30 ~ -15℃放置10 - 30min后再离心 |
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2.沉淀丢失 |
进行弃上清操作时，采用吸取而不是倾倒的方法，勿丢失沉淀 |
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3.样本自身代谢产物多 |
沉淀会分散在离心管壁上，弃上清时沿液面缓慢吸取 |
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各阶段保存时间 |
1. TRIzol NC Reagent 振荡混匀后 |
在4℃保存12h或-20℃保存一周 |
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2.加入75%乙醇后 |
在4℃保存12h或-20℃保存72h |
TRIzol NC Reagent是无需使用氯仿的总RNA提取试剂，广泛适用于培养细胞、动物组织、植物组织等样本。
TRIzol NC Reagent提取过程大约1小时，获得的总RNA可直接用于RT-PCR，qRT-PCR，Northern Blot、Dot Blot、体外翻译和高通量测序等分子生物学实验。建议使用配套SuperFast RT Master Mix for qPCR (gDNA remover)(Cat.No. GK10031)逆转录试剂盒和SYBR Green qPCR Master Mix（Cat.No. GK10002）实时荧光定量PCR试剂盒。
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Sample size and RNA yield |
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Sample type |
Sample size |
RNA yield |
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Leukocyte |
1x106 cells |
10~20μg |
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Plant tissue |
50mg |
10~25μg |
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Cells |
1x106 cells |
10-30μg |
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Tissues such as muscle/brain |
50mg |
10-25μg |
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Liver |
50mg |
100~300μg |
本产品为蓝色溶液，提取RNA过程中，可将蛋白质、DNA、多糖等杂质沉淀于管底，且有明显蓝色沉淀分层，便于吸取RNA上清，可有效去除杂质，保证RNA的完整性和纯度。与传统TRIzol法相比，同等50mg组织样品需要添加0.5ml TRIzol NC Reagent，传统TRIzol Reagent需要添加1ml，更加节约试剂。本产品操作简便，可全程常温操作，并且无需使用氯仿进行分层，安全性更高。
图1 TRIzol NC与常规Trizol操作流程对比图
常见问题：
1. Q: 传统TRIZOL法提取RNA 需要4℃离心，该产品则是常温条件下提取RNA吗？
A：是的，TRIzol NC Reagent可以常温提取RNA，裂解液成分可以充分保护RNA不受降解。如果在冰上操作和4℃则更佳。
2. Q: 裂解液加入稀释液离心之后是否有分层？
A：步骤2.2离心后可看见明显的蓝色下层沉淀和RNA上清液。
3. Q: 加入异丙醇离心后看不见沉淀？
A: 通常情况下，经过异丙醇沉淀可以看见白色胶状沉淀。若遇到沉淀不可见的情况，可能是RNA含量低或者组织投入量过低，建议加大投入量并增加TRIzol NC Reagent的使用量；且在步骤2.5-2.8弃上清操作时，采用吸取而不是倾倒的方法，以免沉淀丢失；取上层溶液，加5-10μg RNase-free糖原作为载体与RNA共沉淀。此外，部分组织材料由于含有较多的代谢产物，导致沉淀不能聚集而分散在离心管壁上，此时，请沿液面缓慢吸取上清，经过75%的乙醇清洗RNA沉淀之后，白色团块状沉淀会聚集和明显。
4. Q: 该产品的适用范围？
A: TRIzol NC Reagent可以提取细胞样品，动物植物组织样品。对血液样本不适用，对动物白色脂肪组织不适用。血液样本建议使用TRIzol LS Reagent（Cat.No. GK20009）。动物白色脂肪组织样本建议使用TRIzol Reagent（Cat.No. GK20008）。
| Components | 100 rxns | 200 rxns |
| TRIzol NC Reagent | 50ml | 100ml |
| Dilution Buffer | 20ml | 40ml |
| 应用&特点 | • Safe and low in toxicity: No need for toxic and harmful reagents such as chloroform and β-mercaptoethanol
• Ease to use: RNA extraction in a monophasic system, no phase separation, all operations at room temperature • High RNA quality: High purity and integrity of RNA at a yield comparable to the traditional Trizol method |
| 运输方式 | Ship with blue ice. |
| 储存条件 | Store at 2-8°C, protected from light for 1 years. |
| 用途 | 仅供研究使用!不能用于人体。 |