Ultra One Step Cloning Kit

1. 准备目的片段

（1）酶的选择：插入片段可使用任意PCR酶扩增，如Taq酶或高保真酶，无需考虑产物末端有无A尾(重组过程中将被去除，在最终载体中不会出现)。为减少突变的引入，建议使用高保真酶扩增片段。

（2）单片段同源重组

 a. 引物设计原则：在插入片段正/反向扩增引物的5'端分别引入线性化载体上插入位点两边的末端序列，即同源臂（15-25bp，不包括酶切位点）。

b. 正向引物：

5'-载体上游末端序列（15-25bp）+酶切位点（可保留或删除）+基因特异性正向扩增引物序列-3'

c. 反向引物：

5'-载体下游末端序列（15-25bp）+酶切位点（可保留或删除）+基因特异性反向扩增引物序列-3

（3）多片段同源重组

a. 引物设计原则：在引物5'端引入同源序列，使多个插入片段之间以及首尾插入片段与线性化载体之间具有能够相互同源重组的完全一致的序列（15-25bp，不包括酶切位点）。

b. 最上游片段正向扩增引物：

5'-载体上游末端序列（15-25bp）+酶切位点（可保留或删除） +基因特异性正向扩增引物序列-3'

c. 最下游片段反向扩增引物：

5'-载体下游末端序列（15-25bp）+酶切位点（可保留或删除）+基因特异性反向扩增引物序列-3

d. 中间各插入片段之间的同源臂，可取自前一段序列3'端15-25bp添加至后一段序列5'端，或后一片段5'端15-25bp添加至前一段序列3'端，也可两段各取一部分作为同源序列，总计15-25bp，分别添加至另一片段末端。

 2. 制备线性化载体：选择合适的插入位点，通过限制性内切酶或反向PCR扩增对载体进行线性化。

注意：

（1）关于插入位点的选择：尽量选择无重复序列且载体克隆位点上下游15-25bp区域内GC含量在40%-60%之间的位置插入目的片段。

（2）如果选用限制性内切酶酶切法制备线性化载体，建议使用双酶切法，单酶切线性化次之，并适当延长酶切时间，减少假阳性的产生。

（3）反向PCR扩增制备线性化载体时，建议使用高保真聚合酶，以减少突变的引入。PCR体系中推荐使用0.1-1ng质粒模板，或使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留造成的假阳性。

3. 重组及转化

（1）浓度测定（已纯化）：

推荐使用NanoDrop、Onedrop、Qubit、PicoGreen等基于吸光值的仪器进行浓度测定目的片段和线性化载体浓度，A260/A280值在1.8-2.0之间为宜。

（2）片段和载体用量：

a. 对于单片段的同源重组，载体与插入片段摩尔比为1:2，推荐载体使用量为0.03pmol，推荐插入片段使用量为0.06pmol，实际插入片段的使用量应大于20ng。可根据实际情况调整用量。

注意：如果插入片段的长度大于载体长度，此时应将片段和载体的使用量互换，将插入片段当做载体、载体当做插入片段进行计算。

b. 对于多片段的同源重组，每种插入片段的实际用量应大于10ng，载体与每种插入片段摩尔比均为1:1，可根据实际情况调整用量。

注意：当使用以下计算公式得出的最适使用量低于10ng时，直接使用10ng即可。

 c. 对于单片段同源重组，如果PCR产物无非特异性扩增条带，可不进行DNA纯化直接使用，加入的总体积应不超过反应体系体积的1/5，即2μl，但重组效率会降低(推荐纯化后进行重组)。

d. 本方案提供一种摩尔数与DNA质量对应关系的粗略计算方法：

对于单片段同源重组反应：

载体推荐用量= [0.02×克隆载体碱基对数] ng(0.03pmol)

片段推荐用量= [0.04×插入片段碱基对数] ng(0.06pmol)

对于多片段同源重组反应：

载体推荐用量= [0.02×克隆载体碱基对数] ng(0.03pmol)

单个片段推荐用量= [0.02×每个片段碱基对数] ng(0.03pmol)

（3）配置反应体系（冰上操作）：

注意：

a. X和Y是根据公式计算得到的各插入片段和载体用量，建议每种组分的实际添加量不低于1μl，以确保加样的准确性。

b.如果X和Y的总添加量大于5μL，建议扩大反应体系，如20μl，同时增加Cloning Mix用量。

c.阳性对照用于排除其他实验材料及操作因素的影响；阴性对照分别用于确认片段和线性化载体中是否有环状质粒残留。

（4）反应条件：

a. 单片段重组反应：50℃，5 min；

b. 2 - 3片段重组反应：50℃，15 min；

c. 4 - 5片段重组反应：50℃，30 min；

反应结束后需转移至4℃或立即置于冰上冷却。

注意：

a. 建议在PCR仪等温控比较精确的仪器上进行反应。

b. 反应时间建议不要超过推荐时间。

c. 重组完成后可立即转化，也可将重组产物于-20℃存放一周，待需要时解冻转化即可。

4. 重组产物转化

（1）将感受态细胞从-80℃冰箱取出，置于冰上融化。

（2）在超净台中，取5-10μl重组产物缓慢加入100μl感受态细胞中，轻弹管壁混匀(请勿振荡混匀)，冰上静置30min。

注意：重组产物转化体积建议不超过所用感受态细胞体积的1/10。

（3）42℃水浴热激30s后，立即置于冰上冷却2-3min。

（4）加入900μl不含抗生素的SOC或LB液体培养基，37℃摇菌1h(200-220r/min)。

（5）菌液经5000r/min(2500g)离心3min，弃掉900μl上清，用剩余培养基将菌体重悬。用无菌涂布棒将重悬菌液均匀涂布到含有相应抗性的平板上，37℃培养箱倒置培养过夜（12-16h）。

5. 阳性克隆筛选

（1）菌落PCR法：挑取单克隆至10μl ddH₂O中混匀作为模板，使用合适的正、反向引物进行菌落PCR鉴定。扩增引物至少使用一条载体上的引物。

（2）酶切法：挑取单克隆至合适抗性的液体培养基中培养过夜，提取质粒进行酶切鉴定。

（3）测序鉴定：挑取单克隆至200-500μL含合适抗性的液体培养基中，37℃摇菌1-3h(200-220r/min)，使用载体上合适引物测序进行测序分析；也可提取质粒后进行质粒测序。

注意事项：

1. 引物设计很重要，同源臂长度在15-25bp为宜（不包括酶切位点），GC含量40%-60%。
2. 线性化载体和插入片段的用量不宜过少或过量，会导致重组效率低或阳性率低，建议参考推荐用量。
3. 未纯化DNA使用体积不应超过反应体系体积的1/5，如果重组效果不理想，建议纯化后再进行连接反应。
4. 感受态效率低可能会造成平板上克隆少的情况，建议不定期对储存的感受态细胞进行验证，确保转化效率>10⁸cfu/μg。