UltraFection 3.0 transfection reagent

使用说明：

尽管以下转染的方法已经充分的验证过，此试剂具有高效的转染效率，但针对每种细胞，还是建议试验人员进行条件优化，通常要考虑以下问题：

1.细胞密度：大多数贴壁细胞密度在50-70%之间，适合转染。确定转染最佳的细胞密度为每一个细胞类型的最大效率和维护密度在所有实验的重现性。

2.培养环境：含血清的培养基对UltraFection 3.0转染无影响。

3.本产品为-20℃保存，使用前建议分装冻存，尽量避免多次反复冻存对转染试剂的影响。

4.DNA纯度和浓度要求：建议选用经过离子交换柱制备的高纯度、无菌的DNA，去除DNA中内毒素的污染是保证最大转染效率的关键步骤。以HEK293细胞为例，24孔板最适DNA转染浓度为每孔转染0.5μg DNA。

5.UltraFection 3.0 和 DNA的标准比例是UltraFection 3.0 ：DNA=3：1，即3μl的UltraFection 3.0对应加入1μg的DNA。但是推荐客户根据实验需要自行优化范围，即根据每1μg DNA的量调节UltraFection 3.0加入的量（2-8μl）。(UltraFection 3.0 和 RNA 的标准比例和用量同DNA)

具体的 DNA 或 RNA 使用量请参考以下表1:

表 1 : UltraFection   3.0推荐转染条件操作方法：

瞬时转染：

以24孔板为例，DNA使用量请参考表1：

1.准备待转染细胞：按照悬浮细胞5x105/孔、贴壁细胞5x104/孔的密度接种于24孔板中，37℃培养过夜；转染前30min，将待转染细胞更换新鲜培养基。

2.准备UltraFection 3.0/DNA复合物：将0.5μgDNA溶于25μl的无血清培养基中，漩涡震荡混匀；将1.5μl UltraFection 3.0加入至25μl无血清培养基中，漩涡震荡混匀，将后者加入前者中，立刻漩涡震荡混匀10s，室温孵育10min。

3.转染：将上述UltraFection 3.0/DNA复合物加入每孔细胞（含培养基450μl），UltraFection 3.0/DNA复合物体积约占总体积的1/10。轻柔摇动24孔板以至复合物分散均匀。37°C孵育24-48h。必要时，转染6h后可换新鲜培养基。

稳定转染：

按照上述瞬时方法转染。转染24h后，将细胞以1:10的比例或更高的比例传代至选择性培养基中。在转染过程中，要设置空转对照组（只含UltraFection 3.0，不含DNA）。定期更换新的筛选培养基以维持细胞在选择性培养基中的生长和传代。在转染1-2周后，大部分的细胞均被杀死，剩余能够在选择性培养基中存活生长的细胞都是稳定表达转染质粒的细胞，即稳定整合到该细胞基因组中的靶细胞。直到稳定表达转染质粒的细胞增殖达到一定数量后才可收集。

注意事项

1. 使用高纯度的DNA（A260/A280 比值不应低于1.8），且无菌无内毒素更有助于获得较高的转染效率。

2. 转染前保证细胞必须处于良好的生长状态以及必要的细胞密度。

3. 低效的复合物(UltraFection 3.0/DNA复合物)、UltraFection 3.0/DNA复合物比例、DNA的纯度和浓度、细胞密度、支原体污染等都有可能造成转染率低。所以在转染之前，请先进行条件优化。

4. 转染基因携带毒性、孵育条件的不佳、DNA质量差及细胞密度低等均可对细胞造成较高毒性。

5. 使用后请立即盖好盖子，避免长时间暴露在空气中，影响转染效率。

6. 为了您的安全和健康，请在符合洁净度要求的细胞培养室中进行转染操作，操作时请穿实验服并戴一次性手套、口罩和无菌帽。